Original title: Struktura a interakce lidského regulačního proteinu 14-3-3: fotoafinitní značení in vitro a hmotnostní spektrometrie.
Translated title: Structure and interaction of human 14-3-3 regulatory protein: photoaffinity labelling in vitro and mass spectrometry
Authors: Mazurová, Martina ; Šulc, Miroslav (advisor) ; Kavan, Daniel (referee)
Document type: Master’s theses
Year: 2016
Language: cze
Abstract: [cze] [eng]
Tato diplomová práce je zaměřena na studium interakcí proteinu 14-3-3ζ, který patří mezi regulační proteiny vyskytující se ve všech eukaryotických buňkách. Význačným rysem proteinu 14-3-3 je jeho schopnost vázat řadu strukturně s funkčně odlišných proteinových ligandů. Tato vazba je většinou realizována prostřednictvím fosforylovaných serinových a threoninových motivů. Cílem této práce je příprava dostatečného množství proteinu 14-3-3ζ s inkorporovaným fotoaktivovatelným analogem methioninu (foto-Met, L-2-amino-5,5-azihexanová kyselina). Byly testovány čtyři různé podmínky rekombinantní exprese v auxotrofním kmeni E. coli B834 (DE3) pro získání proteinu s maximální inkorporací fotoaktivovatelného analogu methioninu do sekvence rekombinantního proteinu. Dalším cílem je studium míry zapojení methioninů 121, 160 a 218 ve vazebném žlábku proteinu 14-3-3ζ a případné nalezení kovalentní vazby s fosforylovaným nebo nefosforylovaným peptidem 251-266 Raf-1 kinázy (fosforylace na Ser259). Pro síťování byla použita metoda světlem iniciované reakce (fotolýza), po které z foto-Met vzniká reaktivní biradikál schopný tvorby nové kovalentní vazby s aminokyselinovými zbytky v blízkém okolí (do 5Å). Nakonec byly analyzovány produkty síťovacích reakcí pomocí MALDI-TOF MS, LC-MS a LC-MS/MS. Zvolenými postupy a... This work is focused on the interactome study of 14-3-3ζ protein, a regulatory protein found in all eucaryotic cells. An important 14-3-3 protein feature is the ability to bind a number of structurally and functionally distinct protein ligands. This link is usually implemented through phosphorylated serine and threonine motifs. The first aim of this work is the preparation of sufficient amount of recombinant 14-3-3ζ protein with incorporated photoactivatable analogue of methionine (foto-Met, L-2-amino-5,5- azihexan acid). The four different conditions of recombinant expression in auxotrophic E. coli B834 (DE3) strain were tested to obtain a protein with a maximal rate of photoactivatable methionine analogue incorporation into the sequence 14-3-3 protein. The second aim is to study the methionine 121, 160 and 218 participation in the 14-3-3ζ protein binding groove and finding of potential covalent bond with the phosphorylated peptide 251-266 of Raf-1 kinase (phosphorylation on Ser259). The photo-initiated cross-linking method was used (photolysis), to form a reactive biradical of methionine analogue capable to attack any amino acid residues in close vicinity (till 5Å). Finally, the products of photo-initiated cross-linking were analyzed by cross-linking reactions using MALDI-TOF MS, LC-MS and...
Keywords: mass spectrometry; photoaffinity labeling; protein structure; fotoafinitní značení; hmotnostní spektrometrie; proteinová struktura

Institution: Charles University Faculties (theses) (web)
Document availability information: Available in the Charles University Digital Repository.
Original record: http://hdl.handle.net/20.500.11956/75909

Permalink: http://www.nusl.cz/ntk/nusl-345310


The record appears in these collections:
Universities and colleges > Public universities > Charles University > Charles University Faculties (theses)
Academic theses (ETDs) > Master’s theses