Original title: Cytochrom P-450: studium struktury a interakcí metodami chemické modifikace, foto-iniciovaného síťování a hmotnostní spektrometrie
Translated title: Cytochrome P-450: Study of structure and interactions using chemical modification, photo-initiated cross-linking and mass spectrometry
Authors: Ječmen, Tomáš ; Šulc, Miroslav (advisor) ; Petrák, Jiří (referee) ; Šebela, Marek (referee)
Document type: Doctoral theses
Year: 2015
Language: eng
Abstract: [eng] [cze]
ABSTRACT Mixed function oxygenase system participates in biosynthesis of endogenous and metabolism of exogenous substances (e.g. drugs or chemical procarcinogens) in an organism. Substrates are biotransformed by terminal oxygenases - cytochromes P450 (P450). Catalytic properties of certain P450s (e.g. studied isoform 2B4) are altered in the presence of a redox partner - cytochrome b5 (cyb5). Both cytochromes are anchored by hydrophobic domains in a lipid membrane of endoplasmic reticulum whereas their catalytic domains are exposed to cytosol. Two zero-length cross-linking approaches were employed to extend present knowledge of P450 2B4 and cyb5 protein structure and protein-protein interactions: (1) interlinking of carboxylate and primary amine groups of amino acids by water soluble 1- ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC), and (2) photo-initiated cross-linking by photo-labile methionine analog (pMet), which links to any amino acid after activation by UV-irradiation, either in hydrophilic or hydrophobic environment. pMet was incorporated to methionine site(s) of cyb5 during recombinant expression in E. coli, which was carried out in limit medium supplemented with amino acid analog. Optimization of experimental conditions led to ~20-30% substitution of the natural amino acid. Covalent... ABSTRAKT Systém oxygenas se smíšenou funkcí se v organismu podílí na biosyntéze endogenních a také metabolismu exogenních látek (např. léčiv nebo chemických prokarcinogenů). Substráty jsou biotransformovány terminálními oxygenasami systému - cytochromy P450 (P450). Katalytické vlastnosti některých jejich zástupců (např. studované izoformy 2B4) jsou pozměněny v přítomnosti redoxního partnera - cytochromu b5 (cyb5). Oba cytochromy jsou ukotveny hydrofobními doménami v lipidické membráně endoplasmatického retikula, zatímco jejich katalytické domény jsou exponovány do cytosolu buňky. K rozšíření současných znalostí o struktuře a interakcích studovaných cytochromů byly využity dva přístupy založené na kovalentním síťování aminokyselin v "nulové vzdálenosti" (angl. "zero-length cross-linking"): (1) chemické síťování činidlem 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) propojujícím ve vodném prostředí přístupné karboxylové skupiny s primárními aminy, a (2) síťování pomocí foto-labilního analogu methioninu (pMet), který se po aktivaci UV zářením může vázat na libovolnou aminokyselinu, a to v hydrofobním i hydrofilním prostředí. pMet byl do sekvence cyb5 inkorporován namísto methioninu během rekombinantní exprese proteinu v E. coli, která probíhala v limitním médiu obohaceném o aminokyselinový...
Keywords: cytochrome P-450; mass spectrometry; photo-initiated cross-linking; protein modification; cytochrom P-450; foto-iniciované síťování; hmotnostní spektrometrie; modifikace proteinů

Institution: Charles University Faculties (theses) (web)
Document availability information: Available in the Charles University Digital Repository.
Original record: http://hdl.handle.net/20.500.11956/65517

Permalink: http://www.nusl.cz/ntk/nusl-334652


The record appears in these collections:
Universities and colleges > Public universities > Charles University > Charles University Faculties (theses)
Academic theses (ETDs) > Doctoral theses