|
|
Imunomodulační potenciál progenitorů Sertoliho buněk v rámci regenerace srdce po poranění na modelu Xenopus
Žabková, Světlana ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Procházka, Jan (oponent)
Vysoké procento úmrtnosti spojené s kardiovaskulárními onemocněními podtrhuje obrovský význam studia regenerace srdeční svaloviny. Zajímavým přístupem pro regeneraci srdce může být použití buněčné kultury progenitorů Sertoliho buněk a peritubulárních myoidních buněk odvozené z varlat juvenilních samců Xenopus tropicalis, která byla označena jako XtiSC. U těchto buněk bylo zjištěno, že sdílí řadu vlastností s mezenchymálními kmenovými buňkami. Právě mezenchymální kmenové buňky jsou známé pro své imunomodulační a protizánětlivé schopnosti podporující regeneraci srdce. Cílem této práce bylo ověřit imunomodulační potenciál XtiSC v rámci regenerace srdce po amputaci apexu srdce na modelu Xenopus tropicalis za nepřítomnosti makrofágů. Důvodem deplece byl předpoklad, že XtiSC se v mnoha aspektech chovají jako makrofágy. Jako nástroj pro depleci makrofágů byl vybrán klodronát enkapsulovaný do liposomů. Bylo potvrzeno, že XtiSC mohou pozitivně ovlivňovat regeneraci srdce jak v klasickém modelu poranění srdce, tak i v modelu s depletovanými makrofágy. Bylo odhaleno, že dospělci Xenopus tropicalis s depletovanými makrofágy, kterým byly 3 dny před apikální resekcí injikovány XtiSC do kosterního svalu zadní končetiny, vykazovaly 7 dní po poškození snížené ukládání fibronektinu a zlepšení regenerace srdeční...
|
|
|
Příprava rekombinantních růstových faktorů X. tropicalis a jejich charakterizace v testikulární tkáňové kultuře
Borecká, Marianna ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Drobná Krejčí, Eliška (oponent)
V Laboratoři vývojové biologie se podařilo založit dlouhodobou kulturu z varlat druhu Xenopus tropicalis. Obsahuje převážně pre-Sertoliho buňky, jejichž podpůrná vyživovací vrstva umožňuje kultivaci kmenových buněk, pravděpodobně sprematogoniálních. Tato diplomová práce si kladla za cíl připravit dva růstové faktory, FGF2 (fibroblast growth factor 2) a GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor), a charakterizovat jejich vliv na zmíněnou kulturu během její kultivace. Faktory byly vybrány na základě teorie o mikroenvironmentální nice, podle které se FGF2 a GDNF jeví jako nejdůležitější pro proliferaci a sebe-obnovu spermatogoniálních kmenových buněk. V rámci diplomové práce se podařilo pomocí expresního plazmidu pET-15b získat rekombinantní FGF2. Jeho charakterizace v testikulární kultuře přinesla velmi překvapivé výsledky. Pre-Sertoliho buňky v jeho přítomnosti během týdenní kultivace odumíraly. Podobný výsledek byl zatím popsán pouze u kultury diferencujících osteoblastů. Další experimenty budou muset prokázat, zda se jedná o apoptózu a proč testikulární buňky reagují tímto způsobem. Klíčová slova: Xenopus tropicalis, FGF2, GDNF, SSC, pre-Seroliho buňky
|
|
|
Fyzické mapování vazebně neidentifikovaných oblastí pomocí BAC klonů u Xenopus tropicalis
Špirhanzlová, Petra ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Marec, František (oponent)
Xenopus leavis, který byl ve 20.století oblíbeným modelovým organismem je v současné době nahrazován diploidním druhem Xenopus tropicalis, který má nejenkratší generační dobu, ale i menší genom. Jedním z nedostatků Xenopus tropicalis je absence úplné vazebné a fyzické mapy. Podle JGI genomové databáze (assembly 4.1) se nachází na krátkém raménku chromozómu 2 a 7 nemapované oblasti, do kterých byly v novější verzi (assembly 7.1) přiřazena řada BAC klonů s osekvenovaným jedním nebo oběma konci. Vyvstává ovšem otázka, zda tyto 100 bp dlouhé sekvence stačí k unikátnímu zařazení BAC klonu do genomu Xenopus tropicalis. S cílem ověření správnosti zařazení těchto BAC klonů v JGI databázi byly vybrány BAC klony, které se podle databáze nachází na krátkém raménku chromozómu 2. Pomocí fluorescenční in situ hybridizace byly tyto BAC klony lokalizovány na metafázních chromozómech. Vybrané BAC klony vykazovaly signál na krátkém raménku chromozómu 1, místo na krátkém raménku chromozómu 2 a ve většině případech byly opačně orientované, což ukazuje na to, že koncová sekvence 100 pb je pravděpodobně nedostatečná k unikátní identifikaci BAC klonu do chromozómu.V rámci této práce byl zaveden funkční protokol pro izolaci a značení BAC DNA
|
|
|
Genetické mapování u rodu Xenopus
Seifertová, Eva ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Ráb, Petr (oponent) ; Marec, František (oponent)
Mezi nejvýznamnější modelové organizmy v oblasti vývojové biologie patří bezesporu obojživelník Xenopus tropicalis. Jeho dřívější využití především v embryologickém výzkumu je v současnosti vytlačováno studiemi genetického a genomického charakteru. X. tropicalis má deset párů chromozómů v diploidním genomu a proto je pro tento typ výzkumu velmi vhodný. V posledních deseti letech byl jeho genom osekvenován, několikrát sestaven, vznikla provizorní genetická mapa a byla vytvořena i BAC knihovna mnohonásobně pokrývající genom. Přes veškeré úsilí se u tohoto druhu doposud nepodařilo sestavit kompletní mapu genomu. Ten i nadále zůstává organizován ve formě scaffoldů, které mají často neznámou polohu a i jejich sestavení zůstává i nadále sporné. Náš výzkum byl zaměřen na kompletaci genomu u druhu Xenopus tropicalis a na nové přístupy, které by bylo možné využít i u jiných druhů. Nejprve byla na základě vazebné analýzy a zjištěné fyzické polohy markerů sestavena genetická mapa. Ta nebyla zcela kompletní- nezahrnovala krátké raménko chromozómu 2 a rovněž 15 cM z p raménka chromozómu 7. Protože bylo zaplnění těchto oblastí klasickými metodami velmi obtížné, nebo ještě pravděpodobněji zcela nemožné, byla vynalezena nová metoda pro genetické mapování. Ta zahrnuje mikrodisekci zvolené oblasti, celogenomovou...
|
|
|
Příprava transgenní kultury testikulárních kmenových buněk Xenopus tropicalis.
Vegrichtová, Markéta ; Tlapáková, Tereza (vedoucí práce) ; Drobná Krejčí, Eliška (oponent)
Testikulární kmenové buňky (TSCs) představují relativně dostupný zdroj potencionálně pluripotentních buněk, které jsou významné zejména pro své uplatnění v regenerativní medicíně. Pro studium migračního a diferenciačního potenciálu kmenových buněk je vhodným modelovým organismem Xenopus tropicalis. Tento obojživelník se vyznačuje vnějším oplozením a embryonálním vývojem značného množství zárodků v rámci jedné snůšky. Oocyty a embrya jsou dostatečně velká (kolem 1 mm) a tím i vhodná pro mikromanipulační zásahy. Laboratoř vývojové biologie PřF UK uspěla v založení smíšené buněčné kultury TSCs rostoucích na podkladové vrstvě pre-Sertoliho buněk. Tato kultura byla odvozena z varlat juvenilního samce X. tropicalis. V rámci studia jejich diferenciačního potenciálu bylo zjištěno, že rozhodujícím faktorem umožňujícím rychlou proliferaci kmenových buněk a jejich formování do charakteristických kolonií je leukemický inhibiční faktor (LIF). Tento protein je produkován oběma typy buněk přítomných v kultuře. Stejný pozitivní vliv na proliferační potenciál kmenových buněk má i myší LIF, což ukazuje na evoluční konzervovanost metabolických drah souvisejících s udržením kmenového charakteru. RT-PCR analýza dále odhalila téměř identický expresní profil u TSCs a podkladových pre-Sertoliho buněk. Na základě těchto...
|
|
|
In vitro diferenciace testikulárních somatických buněk Xenopus tropicalis a Mus musculus.
Hlaviznová, Michaela ; Tlapáková, Tereza (vedoucí práce) ; Hovořáková, Mária (oponent)
Sertoliho buňky (SCs) jsou somatické buňky testikulární tkáně, které se podílí na spermatogenezi a zrání pohlavních buněk. V současnosti jsou intenzivně zkoumány pro své imunomodulační schopnosti a nedávné studie ukazují, že sdílí řadu vlastností s mezenchymálními stromálními buňkami (MSCs). Podrobná charakterizace SCs a objasnění jejich role v testikulární tkáni je klíčové pro využití SCs jako terapeutického nástroje regenerativní medicíny. V Laboratořích vývojové biologie a imunoregulací PřF UK byla založena buněčná kultura nematurovaných Sertoliho buněk Xenopus tropicalis (XtiSCs) a Sertoliho buněk Mus musculus (mSCs). Předchozí výzkum charakterizoval XtiSCs a prokázal jejich multipotentní charakter in vitro diferenciací po mezodermální linii. V návaznosti na tento výzkum byla jedním z cílů diplomového projektu indukce in vitro diferenciace XtiSC do dalších buněčných typů, která by ověřila diferenciační potenciál XtiSCs. Expresní profil mSCs potvrdil somatický původ této kultury a také transkripci genů specifických pro Sertoliho buňky. In vitro byla úspěšně indukována diferenciace mSCs po mezodermální linii do osteoblastů, chondrocytů a adipocytů. Z výsledků této diplomové práce vyplývá, že mSCs sdílí některé charakteristiky myších MSCs a disponují multipotentním diferenciačním potenciálem in...
|
|
|
Diferenciace progenitorů Sertoliho buněk a příprava testikulárních 3D kultur Xenopus tropicalis.
Slováková, Lucie ; Tlapáková, Tereza (vedoucí práce) ; Hovořáková, Mária (oponent)
Sertoliho buňky jsou jediné somatické buňky nacházející se v přímém kontaktu se zárodečnými buňkami. Tyto buňky jsou významnými mediátory procesů vedoucích k vývoji testikulárního niche během embryonálního vývoje. Jejich role v postnatálních varlatech spočívá v regulaci a výživě zárodečných buněk i v tvorbě imunoprotektivní hematotestikulární bariéry. V laboratoři školitelky byla úspěšně založená kultura představující nezralé Sertoliho buňky odvozené z varlat samce X. tropicalis (XtiSCs). V této práci jsem se zabývala indukcí diferenciace XtiSCs v dospělé Sertoliho buňky. In vitro pokusy nepotvrdily diferenciaci buněk v dospělé Sertoliho buňky po stimulaci různými faktory ani po použití primární kultury z 4- letého samce X. tropicalis. Částečný diferenciační proces byl navozen při použití pre-pubertální myší buněčné linie TM4. Výsledky práce naznačují možný potenciál XtiSCs diferencovat v dospělé SCs. Dále byla v práci testována schopnost testikulárních buněk juvenilních samců X. tropicalis formovat de novo organoidy. In vitro pokusy prokázaly schopnost buněk formovat testikulární organoidy v třívrstevném matrigelu.
|
|
|
Genetické mapování u rodu Xenopus
Seifertová, Eva
Mezi nejvýznamnější modelové organizmy v oblasti vývojové biologie patří bezesporu obojživelník Xenopus tropicalis. Jeho dřívější využití především v embryologickém výzkumu je v současnosti vytlačováno studiemi genetického a genomického charakteru. X. tropicalis má deset párů chromozómů v diploidním genomu a proto je pro tento typ výzkumu velmi vhodný. V posledních deseti letech byl jeho genom osekvenován, několikrát sestaven, vznikla provizorní genetická mapa a byla vytvořena i BAC knihovna mnohonásobně pokrývající genom. Přes veškeré úsilí se u tohoto druhu doposud nepodařilo sestavit kompletní mapu genomu. Ten i nadále zůstává organizován ve formě scaffoldů, které mají často neznámou polohu a i jejich sestavení zůstává i nadále sporné. Náš výzkum byl zaměřen na kompletaci genomu u druhu Xenopus tropicalis a na nové přístupy, které by bylo možné využít i u jiných druhů. Nejprve byla na základě vazebné analýzy a zjištěné fyzické polohy markerů sestavena genetická mapa. Ta nebyla zcela kompletní- nezahrnovala krátké raménko chromozómu 2 a rovněž 15 cM z p raménka chromozómu 7. Protože bylo zaplnění těchto oblastí klasickými metodami velmi obtížné, nebo ještě pravděpodobněji zcela nemožné, byla vynalezena nová metoda pro genetické mapování. Ta zahrnuje mikrodisekci zvolené oblasti, celogenomovou...
|
|
|
Studium regeneračního potenciálu progenitorů Sertoliho buněk u pulců Xenopus tropicalis po amputaci ocasu.
Wróblová, Aneta ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Procházka, Jan (oponent)
Žáby rodu Xenopus představují ideální modelový organismus pro studium regeneračních procesů. U žab lze kompletní regeneraci pozorovat ve stádiu pulce. V pozdějších stádiích vývoje je tato schopnost ztracena. V Laboratoři vývojové biologie se podařilo založit buněčnou kulturu společných progenitorů Sertoliho a peritubulárních myoidních buněk (XtiSC) odvozenou z varlat samce X. tropicalis. Tyto buňky vykazují obdobné charakteristiky jako mesenchymální kmenové buňky, jež jsou v současné době předmětem zájmu mnoha vědců pro své imunomodulační vlastnosti a multipotentní diferenciační a regenerační potenciál. V této práci byl studován regenerační a migrační potenciál XtiSC po amputaci ocasu u pulců X. tropicalis ve stádiu 47 - 50. Pro usnadnění transplantačních experimentů byla vytvořena transgenní linie XtiSC exprimující RFP. Pomocí transplantačních experimentů pak byla potvrzena preferenční migrace XtiSC do místa zranění. S využitím pulců X. laevis s vyřazenou funkcí NO syntáz eNOS a nNOS bylo rovněž zjištěno, že migrace XtiSC do místa zranění je zprostředkována signalizací oxidu dusnatého. Imunocytochemickým barvením XtiSC in vitro byla zjištěna pozitivní exprese iNOS, nNOS a Pax7. Imunohistochemické barvení vibratomových řezů ocasu pulců s transplantovanými XtiSC potvrdilo částečnou kolokalizaci...
|
|
|
Regenerative potential of Sertoli cell progenitors regarding heart injury in Xenopus tropicalis
Onhajzer, Jakub ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Procházka, Jan (oponent)
Celosvětově je srdeční selhání jednou z hlavních příčin úmrtí. Léčebný přístup, který by nahradil současný invazivní postup (transplantace s následnou imunosupresivní terapií), v současnosti není k dispozici. Výsledky výzkumu terapie mezenchymálními kmenovými buňkami (MSCs), jasně demonstrují jejich imunomodulační potenciál, který podporuje regeneraci různých orgánů bez nutnosti další podpůrné léčby. V naší laboratoři byla založena buněčná kultura z varlat juvenilního samce Xenopus tropicalis s názvem Xenopus tropicalis immature Sertoli cells (XtiSCs). Tyto buňky mají schopnost modulovat imunitní systém, a po ošetření inhibitorem glykogen syntázy kinázy-3 (GSK-3) CHIR99021 diferencují do kardiomyocytů. Mikroinjekcí takto ošetřených buněk do srdce pulce jsme potvrdili jejich přežití a proliferaci po celou dobu pozorování (30 dní). Na druhou stranu, po přímé injekci buněk do srdce dospělé žáby s následovným poškozením myokardu nebyly v oblasti rány lokalizovány žádné buňky. Z tohoto důvodu jsme změnili experimentální přístup a zaměřili se na nepřímý vliv XtiSC (remote control) na regeneraci srdce pomocí produkovaných růstových faktorů. V této souvislosti jsme upustili od ošetření buněk CHIR99021. XtiSCs byly injikovány do kosterního svalu zadní končetiny, kde bez problémů přežívaly a proliferovaly....
|
host ::
RSS.