|
|
Molecular mechanisms of tumor pathogenesis of Hedgehog signaling pathway in selected tumor types
Kreisingerová, Kateřina ; Vachtenheim, Jiří (vedoucí práce) ; Macůrek, Libor (oponent) ; Uldrijan, Stjepan (oponent)
Předkládaná dizertační práce se zaměřuje na roli signální cesty Hedgehog (HH) v nádorové patogenezi. Signální dráha HH je evolučně velmi konzervovaná signální dráha, která hraje zásadní roli v embryonálním vývoji. V dospělosti je její aktivita silně omezená, aktivovaná je především v kmenových a progenitorových buňkách například mozku, plic, kůže nebo prostaty. Důležitou roli hraje v udržování homeostázy tkání a v jejich regeneraci. Aberantně aktivovaná dráha HH je klíčová v progresi nádorů. Cílem předkládané práce bylo objasnit nové detaily týkající se signalizace HH dráhy. Podařilo se nám identifikovat nový cílový gen HH dráhy - anti-apoptotický protein survivin, jehož exprese je považována za významný nádorový marker spojovaný se špatnou prognózou pacientů. Prokázali jsme, že inhibitor GANT61, který blokuje koncové proteiny HH dráhy GLI1 a GLI2, snižuje hladinu survivinu v nádorových buňkách. Následně jsme GANT61 spolu s inhibitorem BCL2 proteinové rodiny obatoclaxem použili k inhibici růstu melanomových buněk. Tato kombinace se ukázala velmi efektivní v eradikaci melanomových buněk. Prokázali jsme také, že GANT61 spouští v melanomových buňkách proces apoptózy. Zjistili jsme také, že signální dráha Hedgehog je aktivovaná u velkého množství buněčných kultur odvozených od různých typů nádorů. Dále...
|
|
|
Role of the MRN complex in the nucleolar DNA damage response
Palková, Natálie ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Hanzlíková, Hana (oponent)
Zachování integrity genomu je zásadní pro správné fungování a přežití všech organismů, a to zejména, je-li buňka konstantně vystavena nejrůznějším genotoxickým vlivům. Z tohoto důvodu existují mechanismy, které detekují poškození DNA, zajišťují signalizaci a podporují opravu postiženého místa. Tyto mechanismy se souhrnně označují jako odpověď na poškození DNA (DDR). Nezbytnou součástí těchto procesů je také MRE11-RAD50-NBS1 komplex (MRN) složený z proteinů, jako je nukleáza MRE11, ATPáza RAD50 a regulační adaptérový protein NBS1. MRN komplex má nezastupitelnou roli v detekci a časné resekci dvouřetězcových zlomů (DSBs), přenosu signálu, aktivaci ataxia telangiectasia mutated (ATM) kinázy a následných efektorů potřebných pro DDR. Složky MRN komplexu jsou zapojeny v procesech stěžejních pro přesnou opravu poškození DNA, přežití buňky a zachování stability genomu. Hlavním cílem této práce je popsat méně známou úlohu MRN komplexu v jadérku, jaderné organele bez membránového obalu, která se zakládá kolem kopií genů kódujících rRNA. V této práci je rozebráno, jakým způsobem je MRN komplex transportován do jadérka, jak figuruje v opravě dvouřetězcových zlomů rDNA, dočasném zastavení transkripce rRNA nebo v segregaci jadérka. Práce dává do souvislostí nejnovější poznatky v oblasti jadérkové odpovědi na...
|
|
|
The functional in vitro analysis of the BRCA1alternative splicing variants
Ševčík, Jan ; Kleibl, Zdeněk (vedoucí práce) ; Stopka, Tomáš (oponent) ; Macůrek, Libor (oponent)
Úvod: Inaktivace tumor supresorového genu BRCA1 je predispozičním faktorem vzniku karcinomu prsu a ovaria. Vznik funkčně odlišných nádorově specifických alternativních sestřihových variant může být možným mechanismem snižujícím aktivitu BRCA1 v procesu reparace dvouřetězcových zlomů DNA (DDSB). V této práci jsme funkčně charakterizovali dvě alternativní sestřihové varianty BRCA114-15 a BRCA117-19, nalezené v průběhu genetického screeningu jedinců s vysokým rizikem vzniku karcinomu prsu.Metody: Pro funkční in vitro analýzu jsme vytvořili modelový systém klonů buněčné linie MCF-7 stabilně exprimujících zkoumané varianty. Pomocí comet assay a konfokální imunomikroskopie jsme v tomto systému sledovali vliv BRCA114-15 a 17-19 variant na kinetiku reparace DDSB a proliferaci. Aktivita DNA reparačních procesů byla stanovena přímo pomocí in vitro NHEJ assay a nepřímo testem senzitivity na mitomycin C. Proliferační aktivita byla stanovena klonogenním testem a růstovými křivkami. Výsledky: Exprese BRCA114-15 a 17-19 zvyšuje v MCF-7 buňkách úroveň endogenního poškození DNA, zpomaluje reparaci DDSB, negativně ovlivňuje tvorbu reparačních komplexů v počáteční fázi reparace a prodlužuje jejich trvání. Varianty BRCA114-15 a 17-19 rozdílně ovlivňují aktivitu HR, NHEJ a radiosensitivitu MCF-7 buněk. Závěr: Zvýšení exprese...
|
|
|
Zvýšená AID aktivita jako zdroj genomické nestability v klinicky relevantních nádorech
Vaníčková, Karolína ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Macůrek, Libor (oponent)
AID je člen rodiny mutačních enzymů APOBEC. Deaminací cytosinu na uracil generuje v ssDNA nekomplementární U:G páry, které podléhají opravě chybovými DNA reparačními mechanismy. V B buňkách tak zvyšuje mutační nálož Ig lokusů v rámci reakce somatické hypermutace během afinitní maturace imunoglobulinů (Ig). Dále pomocí indukce dvouřetězcových zlomů umožňuje rekombinaci Ig během izotypového přesmyku nebo primární diverzifikaci Ig pomocí templátové genové konverze u některých druhů obratlovců. Při nedostatečné regulaci těchto indukčních a reparačních procesů získává AID tumorigenní potenciál a stává se zdrojem genomické nestability u nádorů. V epiteliálních tkáních je exprese AID aktivovaná prozánětlivými cytokiny pomocí kanonické dráhy NF-B. Původci jsou jak exogenní zdroje (Helicobater pylori nebo HCV), tak endogenní zdroje (žlučové kyseliny), i fyziologické procesy, například ovulace. Proto může být AID pojítkem mezi zánětem a nádory. Ve většině dokumentovaných případů se AID podílí na iniciaci tumorigeneze. Ektopická exprese AID v myších modelech vede ke vzniku karcinomů plic, jater, žaludku, orálních karcinomů a melanomů, v dalších případech se podílí také na epiteliálně-mezenchymálním přesmyku. V případech CML a adenokarcinomů plic je AID zodpovědná za progresi onemocnění a je zdrojem získané...
|
|
|
Role of Rad18 in genome stability
Palek, Matouš ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Šolc, Petr (oponent)
Rad18 je ubikvitin ligáza, která je známá pro svou funkci v dráze tolerance DNA poškození. V minulosti byla intenzivně studována především její účast v translézní DNA syntéze, což je jedna ze dvou drah umožňující toleranci DNA poškození. V nedávné době bylo ukázáno, že se Rad18 také účastní oprav dvouřetězcových zlomů DNA v savčích buňkách. Funkce proteinu Rad18 se tak jeví jako velice důležitá, neboť jak oprava dvouřetězcových DNA zlomů, tak tolerance DNA poškození jsou nepostradatelné pro zachování stability genomu. V této práci představuji funkci Rad18 v toleranci DNA poškození, které je zprostředkováno dvěma drahami, translézní DNA syntézou a replikací s dočasnou změnou templátu. Poté shrnuji současné poznatky o roli Rad18 v opravě dvouřetězcových zlomů. Nakonec se věnuji potenciálnímu přispění deregulace Rad18 k lidským nádorovým onemocněním, neboť ztráta integrity genomu je důležitý faktor umožňující tumorigenezi. Klíčová slova: Rad18, stabilita genomu, oprava dvouřetězcových DNA zlomů, tumorigeneze, tolerance DNA poškození, translézní DNA syntéza, replikace s dočasnou změnou templátu.
|
|
|
Molecular characterization of γ -tubulin interactions with signalling molecules
Macůrek, Libor ; Dráber, Pavel (vedoucí práce) ; Binarová, Pavla (oponent) ; Svoboda, Augustin (oponent)
52 V. CONCLUSIONS The results of presented PhD thesis can be summarized as follows: For the first time it has been demonstrated that γ-tubulin forms complexes with αβ-tubulin dimers in brain tissue as well as in other models of neuronal differentiation. Two forms of γ- tubulin have been identified in complexes of various sizes. It has been shown that γ-tubulin is posttranslationally modified. One of the identified posttranslational modifications of γ-tubulin is phosphorylation that appears to depend on Src family kinase activity. It has been proposed that posttranslational modifications of γ-tubulin may regulate interactions of γ-tubulin with αβ-tubulin heterodimers or other associated proteins during neurogenesis. It has been shown that γ-tubulin associates with protein tyrosine kinases involved in signal transduction events. γ-Tubulin interaction with Src family kinases significantly increased after long-term RA-activation embryonal carcinoma P19 cells. A similar increase has been observed after rapid activation of mast cells, indicating that this regulatory mechanism is not restricted to a particular model system. In both models, Src family kinases bound to γ-tubulin are active and phosphorylate proteins present in γ-tubulin complexes. Fyn kinase interacts with γ-tubulin through its SH2 domain in a...
|
|
|
Investigating critical mechanisms of oncogenesis using cell model systems
Hušková, Hana ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Macůrek, Libor (oponent) ; Vojtěšek, Bořivoj (oponent)
(CZ) Lidé jsou v průběhu života vystaveni různým faktorům způsobujícím poškození DNA, vedoucí ke změnám v buněčné fyziologii a potenciálně k expanzi imortalizovaného buněčného klonu a vzniku nádoru. Mutace v DNA jsou jak záznamem o působení mutagenních procesů, tak klíčem k biologii a patofyziologii nádorů. Masivně paralelní sekvenování umožňuje sekvenování všech kódujících sekvencí či dokonce celých genomů lidských nádorů. Z těchto dat je možné získat vzorce mutací typické pro jednotlivé mutagenní procesy, stejně jako poukázat na mutace a geny hrající roli při vzniku a vývoji nádoru. Řada popsaných vzorců mutací však nemá známou příčinu a řada známých karcinogenů nemá dosud přiřazen mutační vzorec. Stejně tak se předpokládá, že dosud není známa řada mutací a genů s vlivem na vznik nádoru. Tato disertační práce charakterizuje experimentální systém založený na imortalizaci myších embryonálních fibroblastů (MEF) za působení mutagenu, umožňující určení vzorců mutací daných mutagenů a určení mutovaných genů důležitých pro vznik nádoru. Kultivace buněk MEF vede k jejich senescenci, která může být překonána mutacemi ve funkčně důležitých genech, analogicky ke stádiím vzniku lidských nádorů. Sekvenování kódujících sekvencí 25 imortalizovaných buněčných linií, které vznikly za působení rozličných mutagenů...
|
|
|
Studium úlohy genetických faktorů v prognóze a predikci účinku chemoterapie u pacientek s karcinomem prsu
Brynychová, Veronika ; Souček, Pavel (vedoucí práce) ; Macůrek, Libor (oponent) ; Stružinská, Ivana (oponent)
Změny v regulaci apoptózy a buněčného cyklu se uplatňují při vzniku nádoru, při jeho progresi i při rezistenci k protinádorové léčbě. Cílem této práce bylo stanovit význam kaspáz buněčné smrti a regulátorů cytokineze jako možných prognostických a prediktivních markerů u pacientek s karcinomem prsu. Kromě stanovení transkriptu vybraných genů v nádorových a kontrolních tkáních získaných od pacientek s karcinomem prsu jsme se zaměřili na význam alternativních sestřihových variant kaspáz a jejich potenciální geneticky podmíněnou regulaci. Získaná data jsme hodnotili v souvislosti s klinicko-patologickou charakteristikou nádorů, délkou přežívání pacientek bez návratu onemocnění a s odpovědí pacientek na neoadjuvantní chemoterapeutickou léčbu. Součástí práce bylo stanovení expresních hladin na proteinové úrovni a ověření významu vybraných kandidátů pro účinek chemoterapie pomocí funkční studie. Hladiny transkriptu kaspáz 2, 3, 7, 8, 9 a 10, specificky detekovaných sestřihových variant kaspáz 2S, 2L, 3A a B, 3S, 9A, 9B a 8L, a hladiny transkriptu regulátorů cytokineze KIF14 a CIT v karcinomech prsu nesouvisely s délkou bezpříznakového přežívání pacientek ani s odpovědí pacientek na neoadjuvantní léčbu. Zvýšená exprese alternativní antiapoptické varianty kaspázy 9B na úkor hlavní proapoptické varianty 9A,...
|
|
|
Potenciální využití WIP1 fosfatasy v terapii nádorového onemocnění prsu
Pecháčková, Soňa ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Souček, Pavel (oponent) ; Krejčí, Lumír (oponent)
(Czech) Buňky našeho těla reagují na genotoxický stres aktivací signální dráhy, která se nazývá buněčná odpověď na poškození DNA (DNA damage response; DDR). V závislosti na typu poškození DNA, DDR dráha vede k dočasnému zastavení buněčného cyklu v kontrolních bodech (tzv. checkpointech), trvalému zastavení růstu (senescence) nebo k programované buněčné smrti (apoptóza). Aktivace kontrolních bodů buněčného cyklu brání progresi buněk a usnadňuje opravu poškozené DNA. DDR představuje bariéru před nárůstem genomové nestability a chrání buňky před vznikem rakoviny. WIP1 (kódovaná genem PPM1D) fosfatasa je hlavním negativním regulátorem DDR dráhy a je nezbytná pro ukončení kontrolních bodů buněčného cyklu. Tato práce přispěla k pochopení molekulárních mechanismů funkce WIP1 fosfatasy a popisuje, jak může být WIP1 fosfatasa zapojena při vzniku nádorů. Nejprve jsme popsali, že hladina WIP1 klesá během mitózy pomocí APC-Cdc20 komplexu, který způsobuje proteasomální degradaci proteinu. WIP1 je v průběhu mitózy fosforylovaná na několika aminokyselinách, což vede k inhibici její enzymatické aktivity. Navrhujeme, že inhibice WIP1 v mitóze umožňuje reagovat na nízkou hladinu DNA poškození, ke které dochází v průběhu nenarušené mitózy. Dále jsme identifikovali nové aktivační (gain-of-function) mutace genu PPM1D,...
|
|
|
Regulation of cell cycle and DNA damage response in mouse oocytes.
Mayer, Alexandra ; Šolc, Petr (vedoucí práce) ; Macůrek, Libor (oponent) ; Macek, Milan (oponent)
Buněčný cyklus savčích oocytů je dočasně zastaven v průběhu profáze I. meiotického dělení a v tomto stádiu mohou oocyty přetrvávat až několik desítek let. V oocytech proto musí fungovat účinné mechanismy, které je udržují v profázi I a umožňují znovuzahájení meiózy, když je potřeba. Následně, správná segregace chromozomů během maturace oocytů je podmínkou pro vývoj zdravých potomků. Naším cílem bylo zjistit nové role AURKA a PLK1 kináz v regulaci buněčného cyklu. Použili jsme transgenní myši, které nadprodukují wild type (WT-) nebo neaktivní (kinase- dead, KD-) AURKA pouze v oocytech, a ke studiu PLK1 kinázy jsme použili specifický inhibitor BI2536, jehož účinnost je ověřená v somatických buňkách. Naše data ukazují, že jak AURKA tak PLK1 nejsou nezbytné pro znovuzahájení meiózy, i když obě kinázy se tohoto procesu účastní. Aktivní AURKA reguluje proces multiplikace mikrotubuly organizujících center (MTOC) v profázi I, což je první viditelná známka znovuzahajení meiózy. Aktivace AURKA je bifázní, proto primární nárůst počtu MTOC je tranzientní. Plná aktivace AURKA, která je potřebná pro stabilitu MTOC, vyžaduje aktivitu Cyklin-dependentní kinázy 1 (CDK1). Ukázali jsme, že PLK1 se účastní rozpadu jaderné membrány během znovuzahájení meiózy. Jak AURKA tak PLK1 se podílí na akumulaci centrozomálních...
|
host ::
RSS.