|
|
The effect of the environment on bacterial DNA topology and gene expression.
Mikesková, Klára ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Večerek, Branislav (oponent)
Biologické procesy v buňce jsou ovlivněny DNA topologií, tedy strukturou a tvarem DNA. Důležitý topologický ukazatel je úroveň nadšroubovicového vinutí DNA - otáčky DNA navíc jsou uvolňovány pozitivními (otáčení po směru otáčení dvoušroubovice) nebo negativními (otáčení v protisměru) nadobrátkami. V této práci se pojednává o úloze nadšroubovicového vinutí v regulaci genové exprese. Popisuji, jaké je uplatnění nadšroubovicového vinutí v homeostatických mechanismech, které ovládají produkci některých genů na úrovni transkripce. Změny prostředí, jako například změny teploty, oxidativní stres, extrémní pH a antibiotika a jiné inhibitory, ovlivňují úroveň nadšroubovicového vinutí DNA. Nadšroubovicové vinutí DNA poté ovlivňuje expresi enzymů, které ovlivňují DNA topologii, a také další geny a proteiny. Shrnuto, tato práce popisuje, jak změny vnějšího prostředí ovlivňuje DNA topologii a genovou expresi u bakterií se stručnou zmínkou této regulace u eukaryot.
|
|
|
RNA-přepínače jako nástroje regulace genové exprese
Jureček, Matěj ; Folk, Petr (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent)
RNA-přepínače jsou segmenty na 5' UTR nebo v intronech mRNA nebo pre-mRNA, které jsou schopné samy o sobě vázat malou molekulu (většinou metabolit, nukleotid nebo ion) a jako odpověď "přepínat" mezi dvěmi konformacemi, které mohou ovlivnit genovou expresi. Ve většině případů u bakterií mRNA kterou RNA-přepínač reguluje kóduje složku metabolismu ligandu vázajícího se na RNA-přepínač. Na rozdíl od jiných mechanismů regulace genové exprese RNA-přepínače nevyžadují pro regulaci přítomnost proteinů. RNA-přepínače mohou také představovat způsob, jakým hypotetické primitivní formy života regulovaly svou genovou expresi. RNA-přepínače jsou hojné u bakterií a jen málo se jich vyskytuje u eukaryot. Jejich studium se neustále zintenzivňuje a rozšiřuje a dnes by mohly RNA-přepínače lehce představovat samostatné odvětví molekulární biologie.
|
|
|
Rhomboid family intramembrane proteases in prokaryotes: mechanism, substrate repertoires and biological functions in the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis.
Began, Jakub ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
(Czech) Proteázy z rodiny rhomboidů patří do rozsáhlé skupiny serinových intramembránových proteáz, které katalyzují proteolytické štěpení membránových proteinů uvnitř jejich transmembránových oblastí, v hydrofobním prostředí lipidických buněčných membrán. Rhomboidové proteázy byly objeveny v roce 2001 v Drosophila. V průkopnické studii (Lee et al.) byla identifikována zásadní role Rhomboidu-1 (Rhom-1), který v rané fázi vývoje oka octomilky aktivuje signální dráhu receptoru epidermálního růstového faktoru. Rhomboidové proteázy, ať už aktivní proteázy (rhomboidy) či jejich katalyticky neaktivní protějšky (rhomboidové proteiny zahrnující iRhomy a Derliny), jsou silně konzervovány, což naznačuje jejich biologickou významnost. Rhomboidy jsou přítomné napříč živočišnými říšemi, od archea po člověka, zatímco proteolyticky neaktivní rhomboidové proteiny jsou přítomné výlučně v eukaryotních organizmech. Rodina rhomboidových proteinů hraje roli v široké škále rozmanitých biologických procesů, jakými je signalizace ve vývoji metazoí, mitochondriální biogenezi kvasinek, invaze protozoálních parazitů do hostitelských buněk, kvalitativní kontrola proteinů v endoplazmatickém retikulu (ER), či bakteriální quorum sensing. Ze strukturního i mechanistického hlediska jsou rhomboidy nejprostudovanějšími z...
|
|
|
Molecular details of translation reinitiation in budding yeast
Mohammad, Mahabub Pasha ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Mašek, Tomáš (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Eukaryotická iniciace translace je vysoce komplexní proces zahrnující celou řadu fází. Iniciace translace je zahájena sestavením preiniciačního komplexu 43S, který nasedá na 5' čepičku mRNA a následně pročítá mRNA za účelem rozpoznání vhodného AUG start kodónu. Po rozeznání AUG kodónu většina iniciačních faktorů z komplexu 48S disociuje. Některé z těchto faktorů nicméně zůstávají s komplexem 48S přechodně asociované, jedná se například o eIF3 a nejspíše o eIF4G. V rámci této práce jsme vyvinuli metodu RNA-protein Ni2+ -pull down (Rap-Nip), která slouží k in vivo detekci fragmentů mRNA navázaných na eIF3 v kvasinkách. Ukázali jsme, že eIF3 kvasinky Saccharomyces cerevisiae zůstává po iniciaci translace perzistentně navázán na elongujících ribozomech po dobu několika elongačních cyklů. eIF3 navíc stabilizuje post-terminační komplex 40S na stop kodónu krátkých čtecích rámců uORF1 a uORF2 GCN4 a to prostřednictvím kontaktu mezi N-terminální částí podjednotky a/TIF32 a elementy podporujícími reiniciaci (RPEs) příslušného uORF GCN4. S využitím β-galaktosidázového reportérového systému jsme odhalili, že AU- bohatý motiv (motiv AU1-2A/ UUAU2) nacházející se těsně za stop kodonem reiniciačně (REI)-permisivních uORFs podporuje autonomně a místně specificky reiniciaci. Rovněž jsme ukázali, že přesná délka...
|
|
|
Interaction of nucleic acids with RNA polymerase
Janoušková, Martina ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Knejzlík, Zdeněk (oponent)
Regulace genové exprese RNA polymerázou (RNAP) je nezbytnou schopností živých organizmů, která v konečném důsledku umožňuje jejich přežití. Interakce RNAP s nukleovými kyselinami (DNA nebo RNA) je pro transkripci a její regulaci rozhodující. Tato doktorská práce se zabývá dvěma projekty adresovanými k interakci RNAP s nukleovými kyselinami: (i) Transkripcí modifikovaných DNA templátů a (ii) Ms1, malou RNA, v M. smegmatis. (i) Zkoumali jsme vliv modifikací v malém žlábku DNA na bakteriální transkripci in vitro. Zjistili jsme, že transkripce modifikovaných DNA templátů je ovlivněna ve fázi iniciace transkripce a efekt modifikací je závislý na sekvenci promotoru. Dále jsme úspěšně provedli zapnutí a vypnutí transkripce in vitro pomocí bioortogonálních reakcí. Regulace transkripce pomocí umělých modifikací DNA má budoucnost v biotechnologiích a/nebo v medicíně. (ii) Dalšími regulátory genové exprese jsou malé nekódující RNA. Tuto důležitou roli mají tyto molekuly jak v prokaryotech, tak v eukaryotech. Ms1 je malá RNA nalezená v mykobakteriích tvořící komplex s jádrem RNAP. Ms1 se v buňkách nachází ve velkém množství ve stacionární fázi (množství Ms1 je porovnatelné s ribozomální RNA). Zkoumali jsme její syntézu a degradaci v M. smegmatis a došli jsme k závěru, že vysoké množství Ms1 ve stacionární fázi...
|
|
|
Hybridní faktory sigma RNA polymerasy u Corynebacterium glutamicum
Blumenstein, Jan ; Štěpánek, Václav (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent)
půdní bakterie využívaná průmyslu jako producent aminokyselin, nukleotidů, biopaliv a alkoholů. Cílem této práce bylo vytvořit hybridní faktor σ rozpoznávat pouze příslušný hybridní promotor, takže neovlivní e genů. Na základě aminokyselinových sekvencí faktorů σ a σ genů navrženy 2 typy hybridních faktorů σ σ σ σ byly dále na základě přirozeného faktoru σ σ promotoru. Hybridní promotory byly vytvořeny kombinací 10, které pocházely ze σ a σ ů promotorů s použitím prokázalo, že exprese genu σ σ kmeny, které nesly přirozený faktor σ a příslušný promotor. Při použití jednoho z ů σ σ ) se záměnami 35 σ promotorů došlo k a tedy dosažení cíle. Klíčová slova:
|
|
|
Doména 1.1 primárního faktoru sigma a nový systém pro expresi RNA polymerázy z Bacillus subtilis.
Kálalová, Debora ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Cvačková, Zuzana (oponent)
RNA polymeráza (RNAP) je klíčový vícepodjednotkový enzym genové exprese, který spolu s faktorem σ tvoří holoenzym a zajišťuje přepis genetické informace z DNA do RNA. V této práci byla studována RNAP z Bacillus subtilis a její primární faktor σA . Faktor σA určuje specifitu pro promotory, na které holoenzym nasedá. Součástí jeho struktury je doména 1.1, která pravděpodobně vazbou na domény 2 a 4 zabraňuje vazbě samotné σA na promotor, pokud není součástí holoenzymu. První část práce ověřuje hypotézu, zda doména 1.1 váže domény 2 a 4 a brání tak vazbě samotné σA na promotor. Za tímto účelem byly vytvořeny různé doménové konstrukty, u kterých byly testovány vzájemné interakce. Interakce domén byla testována metodami Nitrocellulose filter binding assay, EMSA a transkripcí in vitro. Výsledky neprokázaly významnou interakci mezi doménami. Druhá část práce se věnuje vytvoření nástroje pro studium enzymologie RNAP z B. subtilis - rekombinantní RNAP (rRNAP). Nejprve byl řadou klonovacích kroků vytvořen plazmidový konstrukt pro expresi rRNAP v Escherichia coli, následně byl protein izolován a charakterizován. Izolace se podařila bez kontaminace faktory σ (tato kontaminace je častá při izolaci RNAP z B. subtilis). Byla však zjištěna přítomnost ATP (nikoli GTP) a vazba této molekuly by mohla mít biologickou...
|
|
|
Factors interacting with bacterial RNA polymerase and their effect on the regulation of transcription initiation
Ramaniuk, Volha ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
(ČESKÝ) Bakteriální buňka reguluje svou genovou expresi jako odpověď na změny růstových podmínek. RNA polymeráza (RNAP) je stěžejním enzymem pro tento proces, její aktivita je ovlivňována mnoha transkripčními faktory. Ve své práci se zabývám faktory, které se účastní regulace transkripce u grampozitivních baktérií: faktory σ, iniciačními nukleozid trifosfáty (iNTP), HelD, δ a malou RNA Ms1. Hlavní důraz v této práci je kladen na faktory σ z Bacillus subtilis. Faktory σ rozpoznávají specifickou sekvenci DNA promotoru a umožnují navázaní RNAP na tuto sekvenci. Ve svém prvním projektu jsem vytvořila transkripční systém in vitro s purifikovanými alternativními σ faktory z B. subtilis - σB , σD , σH , σI . Pomocí tohoto systému jsem zkoumala efekt změny koncentrace iNTP ([iNTP]) na iniciaci transkripce. Prokázala jsem, že promotory přepisované pomocí alternativních σ faktorů jsou často regulovány [iNTP]. V dalším projektu jsem charakterizovala jeden z nejméně prozkoumaných alternativních faktorů z B. subtilis, I . Identifikovala jsem ~130 genů ovlivněných I , přitom 16 z nich bylo přepisováno přímoI . Prokázala jsem, že se I účastní metabolizmu železa v buňce, a že se váže nejenom na klasické sekvence -35 a -10, ale také na "prodloužené" -35 a -10 elementy. Ve spolupráci s bioinformatickou...
|
|
|
Bakteriální RNA polymeráza a molekuly ovlivňující její funkci
Jirát Matějčková, Jitka ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Staněk, David (oponent)
RNA polymeráza (RNAP) přepisuje DNA do RNA a je jediným takovým enzymem provádějící transkripci u bakterií. Tento klíčový enzym rozhoduje o odpovědi buňky na vnější i vnitřní signály, rozhoduje o míře transkripce jednotlivých genů a tím reguluje genovou expresi. RNAP ovlivňují nejen vlastní podjednotky, ale i proteinové faktory, malé molekuly či malé RNA (sRNA). Cílem této disertační práce bylo přispět k poznání regulace RNAP a doplnit tak chybějící střípky do tohoto rozsáhlého tématu. Tato práce se zabývá vlivem vybraných proteinů (δ, YdeB, GreA) na citlivost RNAP vůči koncentraci iniciačního nukleosid trifosfátu ([iNTP]) při iniciaci transkripce u Bacillus subtilis. Ukázali jsme, že δ zvyšuje citlivost RNAP k [iNTP] na [iNTP]-senzitivních promotorech, nikoliv však u [iNTP]-nesenzitivních promotorů in vitro ani in vivo. Podjednotka δ je zásadní při soutěži o přežití, neboť umožňuje buňce okamžitě zareagovat na změnu podmínek. Protein YdeB se neváže na RNAP v B. subtilis a zároveň neprokázal žádný viditelný efekt na transkripci in vitro. Zjistili jsme tedy, že proteiny GreA a YdeB na rozdíl od podjednotky δ nejsou schopny ovlivnit citlivost RNAP k [iNTP] u [iNTP]-senzitivních promotorů in vitro. Charakterizovali jsme nově objevenou sRNA u Mycobacterium smegmatis - Ms1, silně produkovanou ve...
|
|
|
Mechanizmus účinku a podstata rozdílné citlivosti bakterií k antibakteriálním látkám lipofosfonoxinům
Havlová, Noemi ; Seydlová, Gabriela (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent)
Lipofosfonoxiny (LPPO) jsou syntetické antimikrobiální látky, jejichž zásahovým místem je cytoplazmatická membrána. I. generace LPPO je účinná proti Gram pozitivním bakteriím, nicméně nevykazuje aktivitu proti Gram negativním bakteriím. Po modifikaci iminocukrového modulu, nosiče pozitivního náboje, vznikla II. generace LPPO, která vykazuje rozšířené účinky proti Gram pozitivním bakteriím a je aktivní i proti Gram negativním, včetně multirezistetních kmenů. Tato práce se zaměřuje na mechanizmus účinku LPPO - zkoumá pórotvornou aktivitu těchto látek na modelových membránách i in vivo. Dále se zabývá podstatou rozdílné aktivity proti Gram pozitivním a Gram negativním bakteriím na modelových bakteriích Bacillus subtilis a Escherichia coli. Výsledky ukazují, že důvodem necitlivosti Gram negativních bakterií k LPPO I. generace, je pravděpodobně jiná stavba buněčné stěny a přítomnost vnější membrány, kterou nejsou schopné překonat. Vliv na antimikrobiální aktivitu LPPO má také fosfolipidové složení cílové cytoplazmatické membrány. Vyšší podíl fosfolipidů s neutrálním nábojem způsobuje sníženou pórotvornou aktivitu u bakterií, ale také stojí za nízkou cytotoxicitou proti eukaryotickým buňkám. Klíčová slova: Antimikrobiální peptidy, lipofosfonoxiny, pórotvorná aktivita, cytoplazmatická membrána, Bacillus...
|
host ::
RSS.