|
|
Study of the organization and dynamics of the membraneless cell compartments
Blažíková, Michaela ; Heřman, Petr (vedoucí práce) ; Cmarko, Dušan (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
doktorské práce Název práce: Studium organizace a dynamiky bezmembránových buněčných kompartmentů Autor: Michaela Blažíková Ústav: Univerzita Karlova v Praze, Matematicko-fyzikální fakulta, Fyzikální ústav UK Vedoucí práce: Doc. RNDr. Petr Heřman, CSc., Univerzita Karlova v Praze, Matematicko-fyzikální fakulta, Fyzikální ústav UK Abstrakt Eukaryotické buňky obsahují množství organel a specifických tělísek. Kromě organel ohraničených membránou jako je např. buněčné jádro, mitochondrie nebo Golgiho aparát, jsou v buňkách i strukturně a funkčně rozlišené bezmembránové struktury. Tato práce se zabývá samo- organizačními procesy, tj. procesy nevyžadujícími specifické interakce, bezmembránových struktur v jádře, cytoplazmě a plasmatické membráně savčích buněk a kvasinek. Konkrétně se jedná o výzkum formace jadérek a Cajalových tělísek v savčím buněčném jádře a processing bodies (P-bodies) v cytoplasmě savčích buněk. Byla též studována organizace MCC domén v plasmatické membráně kvasinek (Membrane compartment of Can1). Bylo ukázáno, že nespecifické interakce v důsledku molekulárního crowdingu mohou být jednou z hlavních hnacích sil formování a stabilizace těchto vysoce dynamických struktur.
|
|
|
Conventional and Novel Functions of the Exocyst Complex in Plants
Kulich, Ivan ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Baluška, František (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
Exocyst je oktamerický proteínový komplex, konzervovaný naprieč ríšou Eukaryota. Jeho úloha, pôvodne popísaná u kvasiniek, spočíva v pútaní sekretorických váčkov k plazmatickej membráne pred samotným splynutím dvoch membrán. Podjednotky exocystu SEC3 a EXO70 sú považované za tie, ktoré určujú miesto pútania váčku k plazmatickej membráne. Zatiaľ čo genóm kvasinky obsahuje jedinú podjednotku EXO70, u suchozemských rastlín ich nájdeme desiatky (23 u Arabidopsis). Táto práca sa zaoberá úlohou komplexu exocyst v rastlinnej bunke. Jej prvá časť dokladá, že exocyst sa významne podieľa na sekrécii komponentov bunkovej steny, obzvlášť pektínov, ale aj pri hrubnutí bunkovej steny vyvolanom interakciou s patogénom. Ďalšia časť odhaľuje novú, nekonvenčnú úlohu podjednotky EXO70B1 (a na nej založenom subkoplexu) pri autofagickom transporte do vakuoly a vyvoláva tak mnoho otáznikov nad rastlinnou sekretorickou dráhou a jej špecifikami.
|
|
|
Regulation of mast cell activation at the level of the high-affinity IgE receptor and STIM1
Bugajev, Viktor ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
(CZ) Tato disertační práce je zaměřena na dva důležité regulátory signalizace žírných buněk. Prvním z nich je komplex vysoce afinního receptoru pro imunoglobulin E (IgE) (FcεRI), který se podílí na získaných (adaptivních) imunitních odpovědí a druhý je stromální interakční molekula 1 (STIM1), která monitoruje hladiny vápníku v endoplasmickém retikulu (ER) a po uvolnění Ca2+ z ER se podílí na otevření vápníkovým uvolněním aktivovaných vápníkových (CRAC) kanálů. I když je struktura FcεRI známá již mnoho let a byla popsána řada molekul asociovaných s tímto receptorem, přesný molekulární mechanismus zahájení a ukončení FcεRI signalizace zůstává nejasný. V této studii jsme vyhodnotili dosavadní poznatky o molekulárních mechanismech iniciace fosforylace FcεRI s důrazem na nově popsaný model, podle kterého vzájemné interakce mezi protein tyrosin fosfatázami (PTPs) a protein tyrosin kinázami (PTKs) nastaví práh tyrosinové fosforylace FcεRI (PTK-PTP interakční model). Dále jsme rozšířili poznatky týkající se topografie fosfatáz citlivých k oxidaci po stimulaci FcεRI v rámci klastrů transmembrálních adaptorových proteinů: T buňky neaktivující "linker" (NTAL) a "linker" aktivovaných T lymfocytů (LAT). Žírné buňky původem z kostní dřeně (BMMC) jsme použili jako modelový systém pro získání nových poznatků o...
|
|
|
Myosin 1c isoforms and their functions in the cell nucleus and in the cytoplasm
Venit, Tomáš ; Hozák, Pavel (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
Souhrn Jaderný myosin 1 je první myosin, který byl nalezený v buněčném jádře. Účastní se procesů jako je transkripce polymerasami I a II, remodelace chromatinu a pohyby chromosomů. Dosud však nebyl popsán přesný mechanismus funkce NM1 v buněčném jádře. Proto jsme připravili myš, která má deleci v genu kódujícím NM1 (NM1 KO). Myo1c je izoforma NM1, která byla charakterizována jako cytoplasmatická. Jediným rozdílem mezi těmito dvěma izoformami je 16 aminokyselin, které obsahuje NM1 na svém N-konci a které byly dříve považovány za jaderný lokalizační signál. Nám se ale podařilo ukázat, že obě izoformy jsou translokovány do jádra, protože jaderný lokalizační signál se nachází v krku, což je doména, která je společná pro obě izoformy. Navíc jsme ukázali, že poměr mezi oběma izoformami je v jádře i v cytoplasmě stejný a delece NM1 nezpůsobuje kompenzační expresi Myo1c. NM1 KO myši jsou životaschopné a vykazují minoritní změny v minerální hustotě kostí a velikosti červených krvinek. Dále jsme zjistili, že Myo1c může NM1 zastoupit ve funkcích jako je transkripce polymerasou I, což naznačuje, že tyto dvě izoformy jsou v buněčném jádře zaměnitelné a duplicitní. V cytoplasmě byla popsána interakce mezi Myo1c a PIP2, lipidem ze skupiny fosfoinositolů. Ukázali jsme, že PIP2 se nachází i v jádře, kde přispívá k propojení...
|
|
|
Charakteristika stresových granulí u kvasinky Saccharomyces cerevisiae
Slabá, Renata ; Hašek, Jiří (vedoucí práce) ; Binarová, Pavla (oponent)
8 ABSTRAKT Ke své správné funkci musí proteiny mít nativní konformaci. Pokud dojde k narušení konformace vlivem vnějších podmínek nebo genetické mutace, proteiny se stávají náchylnější k agregaci. Existují různé typy proteinových agregátů. Mohou se vytvářet různě stabilní bezmembránové inkluze, které slouží k odklizení poškozených proteinů z míst, kde by mohly interferovat s důležitými buněčnými procesy. Jiné typy agregátů mohou sloužit k přechodnému uskladnění proteinů a tím je chránit před poškozením v důsledku stresu. Jedním z těchto přechodných typů agregátů jsou stresové granule (SG), jejichž tvorbu indukuje např. tepelný stres. SG obsahují mRNA, složky translačního aparátu a řadu dalších proteinů. Jedním z nich je protein Mmi1, malý vysoce konzervovaný protein s neznámou funkcí. Jeho asociace se stresovými granulemi a částečná kolokalizace s chaperonem Cdc48 a proteasomem indikuje, že by mohl zprostředkovávat degradaci proteinů poškozených tepelným stresem. Zjistili jsme, že kvasinkový prionový protein Sup35 je také složkou stresových granulí. Vzhledem k jeho schopnostem agregace proto existoval předpoklad, že jeho prionová doména by mohla sloužit jako lešení pro sestavování SG. Nicméně ukázali jsme, že delece prionové domény tohoto proteinu dynamiku tvorby stresových granulí neovlivňuje. Kvasinka...
|
|
|
Regulatory functions of the transmembrane adaptor protein NTAL in activation of mast cells
Tůmová, Magda ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Vyklický, Ladislav (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
SOUHRN Žírné buňky pocházejí z kmenových buněk kostní dřeně. Tyto buňky necirkulují v krvi, ale nachází se v celé řadě tkání, kde jsou často umístěny v blízkosti cév. Žírné buňky jsou součástí přirozeného imunitního systému, ale zároveň ovlivňují i adaptivní imunitní systém a také se účastní alergických a zánětlivých reakcí. Žírné buňky mají na svém povrchu vysokoafinitní receptor pro IgE (FcεRI). Prokřížení tohoto receptoru spouští kaskádu reakcí, která vede k uvolnění předpřipravených a nově syntetizovaných efektorových molekul. Časné fáze aktivace těchto buněk zahrnují tyrosinovou fosforylaci četných substrátů a formování signálních komplexů (v angl. "signalosomes"). Důležité strukturní prvky těchto komplexů jsou transmembránové adaptorové proteiny. Jedním takovým proteinem je adaptorový protein NTAL (Non-T cell Activation Linker), který je velmi rychle fosforylován na tyrosinových zbytcích po prokřížení FcεRI a který slouží jako pozitivní, ale i negativní regulátor signálních drah FcεRI. Abychom byli schopni studovat podrobnou topografii proteinu NTAL a dalších molekul plazmatické membrány u žírných buněk odvozených z kostní dřeně (BMMC), nejprve jsme vyvinuli novou metodu izolace listů plazmatické membrány neadherentních buněk. Tato metoda je založena na adsorpci buněk k ultračistému mikroskopickému...
|
|
|
Nuclear dynamics and interactions of myosin 1c
Dzijak, Rastislav ; Hozák, Pavel (vedoucí práce) ; Hašek, Jiří (oponent) ; Kaňka, Jiří (oponent)
1. ABSTRAKT Myosiny jsou proteiny, které přeměňují chemickou energii uloženou v ATP na mechanickou sílu, která se aplikuje na vlákna aktinu. Jaderný myosin 1 (NM1) byl první myosin detekován v jádře buňky. Spolu s jaderným aktinem hraje důležitou roli při transkripci DNA a remodelaci chromatinu. Nicméně, molekulární mechanismy funkce NM1 jsou zatím neznámé. K získání dalších poznatků o tomto molekulárním motoru jsme studovali expresi a distribuci NM1 v tkáních, mechanismus jeho jaderné lokalizace a také jeho další molekulární interakce. V první části byla studována exprese NM1 v různých tkáních myší. Bylo prokázáno, že NM1 se vyskytuje v buněčných jádrech všech myších tkání, přičemž do studia nebyly zahrnuty buňky v terminálním stádiu spermatogeneze. Kvantitativní PCR a western blot prokázaly, že exprese NM1 je různá v jednotlivých myších tkáních a nejvyšší je v plicích. NM1 je izoforma dříve objeveného myosinu 1c (Myo1c), který byl popsán nejprve jako protein cytosolový. Jediný známý rozdíl mezi těmito dvěma proteiny je přítomnost 16 aminokyselin na N-konci NM1. V další části byl proto studován vliv NM1 domén, včetně N-koncového peptidu, na subcelulární lokalizaci tohoto proteinu. Zjistili jsme, že N-koncový peptid NM1 není nezbytný pro jeho vstup do jádra. Jaderný lokalizační signál jsme objevili v...
|
|
|
Kortikální cytoskelet, exocytický komplex exocyst a jejich role v morfogenzi rostlinných buněk
Fendrych, Matyáš ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Baluška, František (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
Morfogeneze rostlinných buněk úzce souvisí s koordinací plasmatické membrány, cytoskeletu a exocytózy. Forminy jsou proteiny regulující tvorbu vláken aktinového cytoskeletu. Rostlinné forminy náležející do třídy I jsou integrální membránové proteiny, mohou tedy regulovat dynamiku cytoskeletu z pozice membránového proteinu. Zjistili jsme, že formin AtFH4 z Arabidopsis thaliana se váže na mikrotubulární cytoskelet. Doména zodpovědná za tuto vazbu se nachází mezi transmembránovou a "formin homology 1" doménou. V in vitro podmínkách vázal AtFH4 protein aktinová vlákna. AtFH4 se lokalizoval do membrán endoplasmatického retikula, když byl overexprimován v buňkách tabáku. Zároveň tato lokalizace způsobila rozmístění membrán endoplasmatického retikula podél mikrotubulárního cytoskeletu. Z těchto výsledků vyvozujeme, že AtFH4 je schopný být současně umístěn v membráně a svoji vazbou na aktin a mikrotubuly propojovat tyto dva typy cytoskeletu. Rostlinná cytokineze závisí na sekretorické dráze; na exocytóze i endocytóze. Před tím, než sekretorické váčky splynou s plasmatickou membránou, jsou k ní poutány "poutacím komplexem" zvaným exocyst, složeným z osmi podjednotek. Analyzovali jsme mutanty v jedné z podjednotek exocystu A. thaliana - EXO84b. Mutantní rostliny byly zakrslé, nejspíše kvůli porušené sekretorické...
|
|
|
The secretory vesicles tethering complex exocyst and the auxin transport polarization
Janková Drdová, Edita ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Baluška, František (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
U kvasinek a živočišných buněk se na polarizaci exocytózy významně podílí exocyst - oktamerní proteinový komplex, který je řízen pomocí Rab a Rho GTPáz. Nedávno byl exocyst popsán také jako funkční komplex podílející se na morfogenezi rostlin. Hála et al., (2008) objasnil zapojení tohoto komplexu do procesů růstu pylové láčky a elongace hypokotylu etiolovaných semenáčků, Fendrych et al., (2010) odhalil klíčovou roli exocystu při tvorbě nové buněčné přepážky, Kulich et al., (2010) podtrhl význam exocystu při tvorbě semenných obalů a Pečenková et al., (2011) popsala účast podjednotek exocystu v odpovědi rostliny k napadení patogenem. Všechny tyto procesy jsou úzce spjaty s polarizovanou sekrecí. Naše práce ukazuje zapojení exocystu v recyklaci auxinových přenašečů PIN. Přímým měřením auxinového transportu jsme ukázali, že transport auxinu ke špičce kořene mutanta exo70A1 je výrazně zpomalen. Na buněčné úrovni jsme odhalili akumulaci malého množství fúzního proteinu PIN2:GFP do kompartmentů odlišných od endosomů nesoucích VHAa1. Navíc byla v kořenech mutantů exo70A1 a sec8-m1 po působení brefeldinu A výrazně zpomalena recyklace fúzních proteinů PIN1:GFP a PIN2:GFP. Ještě výraznější recyklační defekt byl patrný po prodlouženém působení BFA. Tento přístup vyvolává transcytózu - tj. relokalizaci PIN proteinů z...
|
|
|
Exocyst subunit AtSEC15b: its role in plant cell morphogenesis and characterization of its Rab interacting partner
Toupalová, Hana ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Baluška, František (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
Organizace membránových kompartmentů v eukaryotních buňkách závisí na nepřetržitém transportu membránových váčků. Je známo, že velkou část klíčových regulátorů tohoto transportu představují malé GTPázy z rodiny Rab. Ty cyklují mezi GTP-vazebnou "aktivní" a GDP-vazebnou "neaktivní" formou. Ve své aktivní formě interagují se specifickými efektory a vykonávají tak svou funkci. Exocyst je osmipodjednotkový komplex, který se podílí na regulaci sekrece. Funguje jako efektor Rab GTPáz u kvasinek a savců, kde poutá sekreční váčky k plazmatické membráně před samotným splynutím membrán. S pomocí veřejně dostupných expresních dat jsme nalezli několik kandidátů z rodiny Rab GTPáz, kteří by mohli interagovat s podjednotkou AtSEC15b u rostlin a dokázali, že AtSEC15b specificky interaguje s AtRABA4a GTPázou. Dále jsme ukázali, že stejně jako u kvasinek a savců tato interakci pravděpodobně probíhá v závislosti na GTP-vazebné formě Rab GTPázy, což naznačuje, že je tato interakce zachována v rámci všech Eukaryot. Dále jsme úspěšně předvedli komplementaci teplotně-senzitivního kvasinkového mutanta sec15-1. Na základě tohoto pozorování jsme dospěli k závěru, že protein AtSEC15b je schopen funkčně nahradit kvasinkový protein Sec15 a tím obnovit normální fenotyp. Ko-lokalizační analýza odhalila přítomnost endosomům podobného...
|
host ::
RSS.