|
| |
|
|
Chemická enukleace u savčích oocytů
Černá, Martina ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Předchozi techniky enukleace byly nepřesne a časově naročne. Často se využiva barveni jaderne DNA pomoci Hoechstu, přičemž je barvivo pro oocyt jedovate a ma vliv na jeho dalši vyvoj.Chemicka enukleace je metoda, ktera usnadni vznik cytoplastů ve většim množstvi a v kratšim čase. Budoucnost chemicke enukleace se nachazi na poli biotechnologickem, a to zejmena v oblasti jaderneho přenosu (terapeuticke, reprodukčni klonovani). Chemicka enukleace byla uspěšně provedena u několika modelovych zviřat:myš, ovce, skot. Avšak u prasat je tato technika stale vylepšovana, vzhledem k podobnosti s člověkem, kde by se měla později uplatnit. Bylo zjištěno, že u každeho druhu působi stejne chemikalie jinym způsobem na oocyt a tudiž je nutne zkoumat každy druh zvlašť.Proto byly hledany chemicke latky působici na praseči oocyty, tak aby došlo k vytvořeni vystupku obsahujiciho chromozomy (protrusion). Jako nejvhodnějši pro chemickou enukleaci jsme stanovili demekolcin v koncentraci 0,4 Ug/ml a doba působeni 30 minut (ktery zastavuje polymeraci tubulinu). Dale cytochalasin B v koncentraci 7,5 Ug/ml a doba působeni 10 minut. Uspěšny vznik vystupku obsahujiciho chromozomy (protrusion) koreluje s kvalitou oocytů. Dale jsme se zaměřili na distribuci mitochondrii po fuzi enukleovaneho a neenukleovaneho oocytu. Rovnoměrnou...
|
|
| |
|
|
Vliv ubiquitinace spermií v rámci časného embryonálního vývoje u prasete
Petelák, Aleš ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Metoda intracelulární injekce spermie je velmi efektivním nástrojem pro výzkum oplození. Po vytvoření nové laboratoře na půdě PřF UK bylo nutné nejdříve tuto metodu zavést a charakterizovat časný embryonální vývoj oplozených oocytů. Oocyty byly po oplození kultivovány do stadia blastocysty s úspěšností srovnatelnou s jinými laboratořemi (17%). Ubiquitin-proteazomální systém, který v buňce zajišťuje degradaci proteinů, se účastní regulace maturace a selekce spermií a je nezbytný pro penetraci vitelinní membrány. V těchto dějích je jeho funkce lokalizována extracelulárně. U spermií míra ubiquitinace koreluje s jejich kvalitou. Hypoteticky lze tedy předpokládat, že ubiquitinace nekvalitních spermií slouží jako negativní marker pro jejich rozpoznání a degradaci oocytárním 26S proteazomálním komplexem. Experimenty byly plánovány na základě předpokladu, že výkonnou částí selekčního mechanismu je 26S proteazom a z tohoto důvodu byl sledován vliv inhibice 20S proteazomu, pomocí peptidu MG132, na formování prvojader a následný časný embryonální vývoj po ICSI. Z pohledu zahájení dekondenzace spermie se neprojevil žádný účinek inhibice. Signifikantní rozdíl byl pozorován ve formování prvojader. U skupiny s MG132 docházelo k tvorbě prvojader jen v malém počtu případů (17%, 9%), oproti skupině bez inhibitoru...
|
|
|
Prostředky vyjádření kauzativnosti v češtině a ve španělštině
Petr, Jaroslav ; Čermák, Petr (vedoucí práce) ; Zavadil, Bohumil (oponent)
Prostředky vyjádření kauzativnosti v češtině a ve španělštině Předmětem této diplomové práce jsou, jak je patrné z názvu, prostředky vyjádření kauzativnosti ve španělštině a jejich ekvivalenty v češtině. Zabývali jsme se problematikou kauzativnosti jak z formálního, tak i praktického hlediska. Jako základní materiál nám posloužily nejen španělské, ale i české jazykovědné publikace. Vycházeli jsme zvláště z článku Petra Čermáka a Pavla Štichauera s názvem Španělské a italské faktitivní konstrukce hacer/fare + sloveso a jejich české ekvivalenty, dále z vybraných kapitol Gramática descriptiva de la lengua española z pera různých autorů. Práce se dělí na část teoretickou (kap. 1-4) a na část praktickou (5-6). Na úvod jsme vytyčili cíl našeho směřování, nastínili jsme metodiku výzkumu pomocí paralelního korpusu InterCorp, který jsme podrobně popsali. Na teoretické rovině jsme se zabývali i tím, jaký vliv má na náš výzkum otázka směru překladu. Dále jsme definovali pojmy kauzativnost, kauzativum a faktitivnost, faktitivum, abychom s těmito termíny mohli dále pracovat. Věnovali jsme se podobě kauzativ v češtině a jejich nejvýraznějším vlastnostem, včetně testu pro rozlišení kauzativ od nekauzativ. Pomocí dostupných teoretických zdrojů jsme se pokusili o totéž v oblasti kauzativ španělských; zde jsme za hlavní...
|
|
| |
|
|
Recognition of expressed double-stranded RNAs in mammalian cells
Vaškovičová, Michaela ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Dlhá dvojvláknová RNA je unikátnou štruktúrou, ktorá vzniká počas vírovej replikácie, alebo počas transkripcie repetitívnych sekvencií. Cicavčie bunky si preto vyvinuli niekoľko mechanizmov ako reagovať na dvojvláknovú RNA: interferonovú odpoveď, RNA editáciu, a RNA interferenciu. RNA interferencia je evolučne konzervovanou dráhou, ktorá vedie k sekvenčne-špecifickej degradácii cieľovej mediátorovej RNA. V cicavčích bunkách je však RNA interferencia aktívna iba v myších oocytoch, ktoré exprimujú skrátenú verziu proteínu Dicer, zatiaľ čo v somatických bunkách spúšťa dvojvláknová RNA sekvenčne-nezávislú interferonovú odpoveď. Hlavným cieľom moje diplomovej práce bolo zistiť, akým spôsobom ovplyvňujú proteíny viažuce dvojvláknovú RNA smerovanie dvojvláknovej RNA buď do dráhy RNA interferencie alebo do sekvenčne-nezávislých dráh. Na monitorovanie sekvenčne-špecifických a sekvenčne-nešpecifických efektov dvojvláknovej RNA ko-exprimovanej s proteínmi viažucimi dvojvláknovú RNA sme použili luciferázovú reportérovú esej. Naše výsledky ukazujú, že žiadny z testovaných proteínov nie je schopný stimulovať RNA interferenciu v somatických bunkách. Nadmerná expresia proteínu TRBP2 alebo proteínu PACT prekvapivo potlačuje RNA interferenciu v bunkách produkujúcich skrátenú verziu proteínu Dicer. A čo viac,...
|
|
|
Akrozomální reakce spermií u vybraných druhů savců
Frolíková, Michaela ; Stopka, Pavel (vedoucí práce) ; Jonáková, Věra (oponent) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Savčí spermie musí před oplozením projít sérií fyziologických a biochemických změn v procesu zvaném kapacitace. Vyvrcholením kapacitace je akrozomální reakce (AR). Během AR dochází k exocytóze akrozomálního váčku do extracelulárního prostředí. Spermie, které AR neprošly, nebo se u nich dokonce akrozóm vůbec nevyvinul, nejsou oplození schopné. Výsledkem akrozomální reakce jsou dramatické změny v celé oblasti hlavičky spermie. Dochází k reorganizaci či ztrátě mnohých proteinů přítomných v plazmatické a vnější akrozomální membráně, rozsáhlým změnám v uspořádání cytoskeletu a v neposlední řadě k uvolnění intraakrozomálních proteinů do extracelulárního prostředí a odkrytí nových povrchových domén. Během kapacitace in vitro dochází u určitého druhově specifického počtu spermií ke spuštění akrozomální reakce i bez přítomností indukčního činidla v kapacitačním médiu. Tento jev je označován jako spontánní (zrychlená) akrozomální reakce. Nejnovější výzkumy ukazují, že spontánní AR je přirozenou součástí procesu oplození. Myšice rodu Apodemus vykazují vysokou mírou výskytu promiskuitního chování, a tudíž u nich existuje velké riziko výskytu kompetice spermií. U myšic se vyvinula unikátní reprodukční strategie, kdy se jejich spermie spojují do tzv. spermatických vláčků. Součástí tohoto procesu je spontánní AR,...
|
|
|
Retrovirová infekce kuřecích testikulárních buněk v procesu tvorby transgenní drůbeže
Kalina, Jiří ; Škvor, Jiří (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent) ; Jílek, František (oponent)
Biotechnologický výzkum v oblasti transgenní drůbeže není díky velmi specifickému rozmnožování ptáků zdaleka tak úspěšný jako u savců. Předkládaná práce se pokouší nabídnout komplexní přístup řešení jedné z možných technik tvorby transgenní drůbeže. V průběhu práce byla ověřena možnost použití obvyklých transfekčních technik na kulturách blastodermálních a testikulárních buněk. Byla propracována původní funkční technika sterilizace kohoutích varlat a obnovení spermatogeneze transplantací testikulárních buněk kohouta dárce. Značené transplantované buňky rekolonizovaly prázdné tubuly sterilních varlat a obnovily spermatogenezi. Byl vytvořen retrovirový konstrukt s markerovým transgenem pro expresi zeleného fluorescenčního proteinu (GFP), kterým byly infikovány transplantované testikulární buňky. Po obnovení spermatogeneze byl v DNA spermií detekován markerový transgen, přičemž u infikovaných buněk nebyla zjištěna signifikantní metylace integrované DNA. Metodou průtokové buněčné cytometrie byla analyzována směs testikulárních buněk a byly popsány a identifikovány populace testikulárních buněk, včetně tzv. side population buněk (SP), možné skupiny kmenových spermatogoniálních buněk.
|
|
|
Transgenic RNAi in mouse oocytes
Sarnová, Lenka ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
RNA interference (RNAi) is double-stranded RNA (dsRNA)-mediated mRNA degradation. RNAi has been widely used to investigate gene functions. Many methods to induce transient or stable RNAi have been developed. Transient RNAi can be induced by delivering of a long dsRNA or short interfering RNAs (siRNAs). Stable RNAi may be induced by introducing plasmids expressing a long or a short hairpin RNA. Both small and long RNAs have been used to induce transient RNAi in mouse oocytes. Nevertheless, only long hairpin-expressing system has been used to trigger stable RNAi in oocytes. Although, this system appeared to be highly efficient and specific, it has several disadvantages as complicated long inverted repeat cloning or limited possibility to test these vectors in the cell culture. Here, we constructed a short hairpin-expressing vector suitable for transgenic RNAi induction in mouse oocytes. The new vector, pTMP_ZP3_sh, was derived from a lentiviral short hairpin vector selected based on comparative study of different short hairpin-expressing plasmids. The pTMP_ZP3_sh vector was tested by targeting Moloney sarcoma oncogene (Mos) mRNA, which is a common model for RNAi in mouse oocytes. We designed several candidate short hairpin sequences and tested their efficacy. Subsequently, the most efficient one was selected...
|
host ::
RSS.