|
Cell cycle and differentiation in Giardia Intestinalis
Jiráková, Klára ; Nohýnková, Eva (vedoucí práce) ; Doležal, Pavel (oponent) ; Müller, Norbert (oponent)
Giardia je jednobuněčný parazitický organismus, který je zdrojem průjmových onemocnění po celém světě. Má minimální genomovou výbavu a zjednodušené molekulární a metabolické dráhy. V tomto ohledu je to vhodný modelový organismus pro studium regulace buněčného cyklu a pro definici minimální genetické a proteinové výbavy nutné pro reprodukci eukaryotické buňky. V životním cyklu giardie se vyskytují dvě stádia: patogenní trofozoit a infekční cysta, která dokáže přežít ve vnějších podmínkách. Nové znalosti o encystaci mohou být významné z terapeutického hlediska, protože na tento proces je zacílen vývoj vakcíny a léků. Protože studium buněčného cyklu vyžaduje synchronizovanou populaci, studovali jsme vliv synchronizační látky aphidicolinu na jednotlivé buněčné děje během buněčného cyklu trofozoitů giardie. Naše výsledky ukázaly, že aphidicolin zastavil syntézu DNA a trofozoiti byli zablokováni podle obsahu DNA na hranici G1/S fáze. Následná inhibice vstupu do mitózy a cytokineze naznačuje, že Giardia má funkční kontrolní bod při poškozené DNA. Aphidicolin působí při dlouhodobé inkubaci a vyšších koncentracích vedlejší efekty; detekovali jsme pozitivní signál pro fosforylovaný histon H2A, který je u savčích buněk součástí signalizační dráhy spuštěné jako reakce na dvouřetězcové zlomy v DNA....
|
|
Interakce hem-protein v cytochromech P450
Majerová, Kristýna ; Hudeček, Jiří (vedoucí práce) ; Stiborová, Marie (oponent)
Cytochromy P450 (CYP) jsou významné enzymy podílející se na biotransformaci xenobiotik oxidačními reakcemi. Bližší poznání okolí hemu a detailní znalost interakce hem- protein jsou důležité pro pochopení funkce těchto enzymů. Na základě dostupných krystalografických dat byla provedena analýza orientace vinylových postranních řetězců hemu, lokalizace aminokyselinových zbytků v blízkosti postranních řetězců (vinylů a propionátů), analýza disociačních konstant a Coulombických interakcí u těchto zbytků a byly zkoumány odchylky hemu od planarity. Z distribuce hodnot torzních úhlů u vinylů v pozici 2 a v pozici 4 vyplývá, že vinyly v pozici 2 jsou u většiny zkoumaných forem konformačně omezenější a jejich torzní úhly spadají do užšího intervalu ve srovnání s vinyly v pozici 4. Srovnání různých forem CYP přitom ukazuje, že preferované intervaly torzních úhlů se liší. Distribuce konformací vinylové skupiny tedy odráží spíše vliv apoproteinu než nějakou vnitřní tendenci hemu jako takového. Z analýzy mimorovinných deformací hemu vyplývá, že u CYP2B4 a CYP3A4 se nejvíce uplatňuje tzv. sedlová deformace (sad). Výsledky poukazují na velkou variabilitu P450, na vliv interakce hem- protein na strukturu a funkci enzymu.
|
|
Vliv faktorů prostředí na vývoj plodu u savců
Sedláčková, Lucie ; Bartoš, Luděk (vedoucí práce) ; Bučková, Katarína (oponent)
O vývoji plodu se mluví od chvíle splynutí samčí a samičí pohlavní buňky, spermie s vajíčkem, a vzniku zygoty. Touto událostí začíná složitý proces prenatálního vývoje, období velice citlivého na změny a nepříznivé podmínky v okolí matky. Do takových podmínek může být zahrnuta nedostatečná výživa, náhlé změny sociálního okolí matky, vysoký výskyt predátorů, stresové zážitky kvůli nepřiměřené manipulaci a mnoho dalších. Vše spojuje jeden často skloňovaný pojem - stres.
Stres totiž způsobuje nadměrné vyplavování hormonů glukokortikoidů, kterým je například kortizol. Tento glukokortikoid je nezbytný pro růst plodu a indukci některých enzymů, jako například plicní povrchově aktivní látky. Za určitých podmínek však může maternální kortizol vystoupat do abnormálních hodnot. V důsledku toho přebytek kortizolu zasáhne plod ve vysokých koncentracích, které mohou negativně měnit fetální růst a vývoj.
U savců stres matky během gravidity nejen zvyšuje její vlastní kortizol, ale také snižuje expresi a aktivitu glukokortikoidního bariérového enzymu 11beta-HSD2 v placentě, takže plod je méně chráněn. Na druhé straně je tak ovlivněna placentární produkce a metabolismus jiných proteinů a hormonů citlivých na glukokortikoidy jako jsou prostaglandiny, progesteron, estrogeny, transportér glukózy a placentární laktogen. Navíc inhibice 11beta-HSD2 prenatálním stresem by mohla přispět k nízké porodní hmotnosti a poruchám těhotenství, jako je předčasný porod.
Prenatální stres ovlivňuje především vývoj mozku. Jsou pozorovány účinky prenatálního stresu u savců se zvýšenou latencí pro hru, nepřímým lokomočním chováním, úzkostí a zhoršenou pamětí. Prenatální stres je také spojován s větší těkavostí a poruchami pozornosti, s tím souvisí i snížená schopnost učení. Je prokázáno, že prenatálně stresovaní jedinci mohou vykazovat zvýšené agresivní chování, u samců bylo pozorováno chování demaskulinizované a feminizované.
Účinky prenatálního stresu jsou přenosné i na další generace a existují důkazy, že se ve větší míře projevily až na generacích následujících.
|
|
Regulace aktivity a aktivace kathepsinu D
Máša, Martin ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Jonáková, Věra (oponent) ; Holada, Karel (oponent)
Disertační práce SOUHRN REGULACE AKTIVITY A AKTIVACE KATHEPSINU D Martin Máša školitel: Michael Mareš Katedra biochemie Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy Ústav organické chemie a biochemie Akademie věd České republiky PRAHA 2009 Úvod Kathepsin D (KD) je lysozomální aspartátová peptidasa přítomna ve všech savčích organizmech, její hlavní funkcí je katabolická degradace proteinů. Dále je zapojen v řadě fyziologických procesů jako jsou apoptóza a tkáňová homeostáze, podílí se na regulaci angiogeneze a na tvorbě peptidových antigenů. Z hlediska patofyziologie je KD studován ve spojitosti s několika chorobami jako jsou Alzheimerova choroba a rakovina. Alzheimerova choroba je neurodegenerativní onemocnění mozku obecně považované za nejběžnější příčinu senilní demence. V průběhu nemoci dochází k ukládání plaků β-amyloidních peptidů (β-AP) na povrch neuronů, což vede postupně k jejich atrofii a rozpadu. β-AP vznikají proteolytickým štěpením amyloidního prekurzorového proteinu (APP) nejčastěji tzv. sekretasami1 . U pacientů s Alzheimerovou chorobou byly nalezeny vysoké koncentrace KD v mozkomíšním moku2 . Bylo ukázáno, že KD je schopen štěpit APP za vzniku patogenního β-AP a přispívat tak k rozvoji Alzheimerovy choroby3 . U pacientů s Alzheimerovou chorobou byl v genu KD nalezen minoritní polymorfizmus,...
|
|
Role proteinu Prp45 v expresi a zrání mRNA
Abrhámová, Kateřina ; Půta, František (vedoucí práce) ; Pichová, Alena (oponent) ; Janderová, Blanka (oponent)
Souhrn Prp45p ze Saccharomyces cerevisiae a Snw1p ze Schizosaccharomyces pombe jsou pro eukaryotní buňku nepostradatelné proteiny, které vykazují vysoký stupeň homologie se savčím transkripčním regulátorem a nestřihovým faktorem SNW/SKIP. Analyzovali jsme esenciální funkci těchto proteinů v obou kvasinkách a nalezli mutaci (prp45(1-169)), která u mutantního kmen s odpovídající chromozomální delecí způsobuje citlivost vůči vyšší kultivační teplotě a hypersenzitivitu vůči cykloheximidu, hydroxymočovině, látce calcofluor white a inhibitorům polymerizace mikrotubulů. Při kultivaci ve 30řC jsou tyto kvasinky často prodloužené, deformované a větší než wt. Po synchronizaci ve 37řC zastavují kvasinky prp45(1-169) svůj růst s dvojnásobným obsahem DNA. Zjistili jsme, že teplotní senzitivita kmene prp45(1-169) není překonána a hypersenzitivita vůči mitotickým jedům je jen částečně potlačena odstraněním intronu z genu TUB1. To odlišuje prp45(1-169) od těch mutant v sestřihových faktorech, jež vykazují na tubulinu závislý blok v G2/M fázi, který může být překonán pomocí verze tub1 bez intronu . Pomocí analýzysestřihu in vitro jsme zjistili, že sestřih optimálních substrátů není narušen. Porovnávali jsme stabilitu a obsah RNA mezi prp45(1-169) a wt kvasinkami při různých teplotách pomocí microarray analýzy. Expresi a...
|
|
Genome reprogramming during the first cell cycle of embryonic development
Barnetová, Irena ; Fulka, Josef (vedoucí práce) ; Pěknicová, Jana (oponent) ; Strejček, František (oponent)
Spermie obsahuje vysoce kompaktní genom. Tato kompaktnost je zprostředkována protaminy. Během oplození jsou protaminy spermie nahrazeny histony z cytoplazmy oocytu. Vedle výměny proteinů nastává i epigenetická remodelace. Mezi nejvíce studované epigenetické remodelace patří aktivní demetylace paternálního prvojádra. Tento jev byl pozorován u některých savců (myš, krysa, opice). Naopak u jiných druhů savců (ovce) aktivní demetylace prokázána nebyla. U některých druhů byly dokonce pozorovány obě varianty (prase, člověk, koza, králík). Práce se zaměřuje na modelový druh prasete a pokouší se objasnit důvody rozporuplných výsledků aktivní demetylace paternálního prvojádra pozorovaných u prasete. V této práci byly prověřeny tři možné faktory - technika produkce embryí, faktory spermie a kvalita oocytů. V první části práce byly porovnány zygoty vytvořené pomocí IVF (klasické in vitro oplození) a ICSI (intracytoplazmatická injekce spermie). Epigenetická remodelace prvojader byla analyzována pomocí nepřímé imunofluorescence. Mezi zygotami nebyl pozorován žádný signifikantní rozdíl. Paternální genom nepodléhal aktivní demetylaci ani v jednom typu embryí. Značení pomocí anti-H3/K9-me2 (dimetylace na lysinu 9 histonu 3) ukázalo pozitivní signál v obou prvojádrech přibližně v polovině případů. Druhá část práce...
|
| |
|
Vliv ekotoxikologických faktorů na spermatogenezi, morfologii a funkci spermie savců
Vašinová, Jitka ; Pěknicová, Jana (oponent) ; Hortová, Kateřina (vedoucí práce)
Narůstající neplodnost jako důsledek patologických změn spermií je aktuálním problémem současnosti. Jedním z potenciálních faktorů, které negativně ovlivňují samčí plodnost, mohou být mimo jiné rostoucí koncentrace fluoridů v životním prostředí. Ekotoxikologický efekt fluoridů může být navíc zesílen v přítomnosti hliníkových iontů, se kterými fluoridy vytváří fluoro-hlinité komplexy, které se chovají jako analogy fosfátových skupin. Tyto komplexy interferují s aktivitou G-proteinů a P-typem ATPáz, důležitými součástmi signálních drah během spermatogeneze a maturace spermií. Cílem této práce bylo sledovat vliv fluoridů na kapacitaci myších spermií in vitro a histologicky analyzovat vliv fluoridů na reprodukční orgány samců a míru spermatogeneze u myší. Fluoridy byly podávány v pitné vodě v koncentracích 0, 1, 10 a 100 ppm a současně bylo sledováno jejich synergické působení s hliníkem, který byl podáván v množství 10 ppm. Hlavním markerem úspěšně probíhající kapacitace in vitro byla míra tyrozinové fosforylace v hlavičce spermií. Získané výsledky ukazují, že nadměrná zátěž organizmu danými ionty negativně ovlivňuje spermatogenezi i schopnost spermií kapacitovat in vitro. Multigenerační studie navíc prokázala, že s postupem generací se nejvíce škodlivými stávají nízké koncentrace fluoridů hliníku,...
|
|
Periferní cirkadiánní hodiny savců, jejich molekulární mechanismus a synchronizace
Polidarová, Lenka ; Kuthan, Martin (oponent) ; Sumová, Alena (vedoucí práce)
Mammalian circadian clock in peripheral organs, molecular mechanism and entrainment The circadian system controls timing of behavioral and physiological processes in most organisms. In mammals, central oscillator is located in the suprachiasmatic nuclei (SCN) of the anterior hypothalamus. Apart from the SCN, peripheral oscillators are located in numerous organs like liver, heart, lung, muscle, intestine etc. The central and peripheral oscillators need to be synchronized by external cues (Zeitgeber). The SCN coordinates and entrains the phase of the clocks in numerous peripheral tissues via neuronal and humoral signals. For the SCN, dominant synchronizer is external light-dark cycle. Peripheral oscillators are cell-autonomous, they could work also independently of the SCN as a consequence of a feeding cycle. The basic molecular core clock mechanism responsible for generating circadian rhythms in the central and peripheral clocks is composed of transcriptional/translational feedback loops between the clock genes and their protein products. The aim of the present thesis was to ascertain whether the clock gene and protein expressions exhibit circadian rhythms in the rat intestine and whether the core clock mechanism drives expression of a cell cycle regulator rWee1. Next aim was to reveal how the circadian...
|
|
Signalizace protein kinázy B a exprese cyklooxygenáz v časných fázích diabetické nefropatie
Ždychová, Jana ; Komers, Radko (vedoucí práce) ; Haluzík, Martin (oponent) ; Matoušovic, Karel (oponent) ; Škrha, Jan (oponent)
Akt kináza (Akt) je součástí kaskád převádějících signály vasoaktivních a růstových faktorů. Akt- dependentní procesy se podílejí na regulaci mechanismů relevantních pro renální patofyziologii jako jsou syntéza proteinů, viabilita, produkce NO, reabsorbce sodíku atd. Poruchy regulace renálních isoforem cyklooxygenáz produkujících biologicky významné prostanoidy mohou rovněž přispět k známým patofyziologickým mechanismům v rozvoji nefropatie a hypertenze jako důsledek molekulárních abnormalit při diabetu. Cíl: Práce je zaměřena na studium aktivity Akt a jejích efektorů, proteinů "mammalian target of rapamycin"(mTOR) a endoteliální NO syntázy (eNOS), spolu s expresí a aktivitou cyklooxygenázy 2 (COX2) v časných fázích diabetu a jejich úlohu v patofyziologii renálních moďologických a hemodynamických změn při diabetu. Materiál a metody: Aktivita Akt v renálním kortexu byla měřena pomocí kinázové assay. Exprese proteinů byla kvantifikována immunoblottingem. Studie byly prováděny na modelu DMI, tj. na potkanech u nichž byl diabetes navozen podáním streptozotocinu. Pokusná zviřata byla rozdělena do 3 skupin. První skupina diabetických zvířat byla ponechána bez léčby (STZO), druhá skupina (STZ4) byla léčena 4 jednotkanň insulinu denně a třetí skupina (STZ 12) byla léčena 12 jednotkanů insulinu denně. Cílem...
|
host ::
