|
|
Preparation of mouse monoclonal antobodies against cyclin-dependent kinase
Šupák, Marek ; Ševčíková,, Sabina (oponent) ; Kohoutek,, Jiří (vedoucí práce)
The aim of this master‘s thesis is to prepare a monoclonal antibody against cyclin-dependent kinase 13 (CDK13). The theoretical part focuses on antigen-antibody binding, which is essential for the use of monoclonal antibodies in the determination of CDK13 as well as the transcription that this kinase affects. This section is also devoted to Western blot and ELISA methods for detection of newly generated antibodies. Furthermore, the antibodies and the antigen definition are stated, which are later on discussed. The practical part is devoted to the preparation of antigen - its isolation and purification on a peristaltic pump. It also addresses immunization, its course, and the amount of antigen used to immunize mice. After immunization, the work focuses on fusion of sp-2 cells and splenocytes, which were first removed from the immunized mouse and purified. After the fusion alone, selection of hybridomas on HAT selection medium is mentioned, followed by detection first by ELISA and later by Western blotting. The resulting hybridomas with positive ELISA response are frozen for further testing at the Veterinary Research Institute in Brno, where the entire practical part of this thesis was carried out. These frozen hybridomas are further tested by immunoprecipitation to conclude this thesis.
|
|
|
Protilátková odpověď vrubozobých ptáků proti ptačím schistosomám
HAVELKOVÁ, Markéta
Motolice rodu Trichobilharzia jsou typicky dvouhostitelští parazité využívající vodní plže jako mezihostitele a ptáky jako definitivní hostitele. Infekční stádia volně plovoucí ve vodě jsou však schopná penetrovat i kůži savce, včetně člověka, a tím vyvolávat hypersenzitivní reakci známou jako cerkáriová dermatitida. Infekce neurotropním druhem T. regenti vyvolává u kachen zvýšení hladiny protilátek třídy IgY specificky rozpoznávajících určité parazitární antigeny. V této práci byly stanoveny tyto parametry u dvou dalších příbuzných, viscerálních druhů, T. szidati a T. franki, a současně byly charakterizovány zkřížené reaktivity protilátek v sérech nakažených kachen vůči heterologním antigenům pomocí ELISA a Western blotu. Protilátky kachen nakažených T. szidati vykazovaly velmi nízkou reaktivitu s antigeny všech tří parazitárních druhů, na rozdíl od protilátek kachen nakažených T. franki i T. regenti. Dříve identifikované silně imunogenní antigeny T. regenti byly zhodnoceny jako druhově nespecifické pro všechny hodnocené druhy trichobilharzie, avšak použitelné pro diagnostiku nákazy ptačími motolicemi u volně žijících jedinců.
|
|
|
Involvment of PDA3 in oxidative stress response
Ženklová, Lucie ; Vokřál, Ivan (vedoucí práce) ; Jirkovský, Eduard (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Studentka: Lucie Ženklová Školitelé: Prof. Fabio Altieri Ph.D. a PharmDr. Ivan Vokřál, Ph.D. Název diplomové práce: Involvement of PDIA3 in oxidative stress response PDIA3 je členem rodiny protein disulfid isomeráz (PDI) a jedná se o protein, uplatňující se při odpovědi organismu na stres. Dále je zapojen do různých buněčných signálních drah a má v buňce nejrůznější funkce. Jeho nejznámější role je v endoplazmatickém retikulu, kde plní funkci hlavně při skládání a kontrole kvality glykoproteinů. Nicméně jeho existence byla popsána také v mnoha jiných buněčných kompartmentech, například v jádře, mitochondriích, na buněčném povrchu nebo v cytosolu, kde zasahuje do nejrůznějších procesů (fúze spermie s vajíčkem, negenomická odpověď na vitamín D3, příjem vápníku buňkou,transkripční faktor v jádře atd.). Zatímco v některých případech musí být mechanismus jeho působení potvrzen dalšími studiemi, četná pozorování potvrzují jeho účast v přenosu různých signálů z buněčného povrchu (např. kooperce se STAT proteiny) a v regulačních procesech v jádře. V nedávných studiích byla také potvrzena jeho zvýšená exprese při různých patologických procesech. Cílem naší práce bylo zjistit, jaká je úloha PDIA3 proteinu při...
|
|
| |
|
|
Detekce a kvantifikace inhibitorů proteáz v klíštěti \kur{Ixodes ricinus} pomocí monoklonálních protilátek
VANÍČKOVÁ, Martina
Inhibitory proteáz v klíštěti hrají hlavní roli v průběhu sání klíštěte. Sliny klíštěte obsahují bioaktivní látky, díky kterému je schopné modulovat hostitelovu imunitu v průběhu sání, a tak nerušeně sát po neomezeně dlouhou dobu. V průběhu dlouhého sání tak může docházet i k přenosům klíšťaty přenášených chorob. Narušením funkce inhibitorů proteáz může být snížen přenos patogenů. V této práci jsem se zabývala výrobou monoklonálních protilátek, které jsem použila k detekci a kvantifikaci dvou inhibitorů serinových proteáz v orgánech a slinách klíštěte obecného.
|
|
|
Měření aktivace signálních drah v myší makrofágové linii IC-21 a primárních dendritických buňkách po infekci virem klíšťové encefalitidy.
Kožantová, Jana ; Lieskovská, Jaroslava (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
Klíšťová encefalitida je závažným onemocněním centrální nervové soustavy. Je způsobena virem klíšťové encefalitidy, který je přenášen klíšťaty. Česká republika patří mezi země s největším výskytem této nemoci. Virus klíšťové encefalitidy je schopen se replikovat v několika buněčných typech. V práci jsme se zaměřili na makrofágovou linii IC-21 a dendritické buňky, protože jsou to jedny z prvních buněk přicházejících do kontaktu s virem a zároveň napomáhají šíření viru v hostiteli v počáteční fázi infekce. Dosud není znám specifický receptor pro vstup viru do buňky, ani které signální dráhy aktivuje. Proto jsme se rozhodli prozkoumat aktivaci vybraných signálních drah po infekci virem klíšťové encefalitidy a ovlivnění této aktivace klíštěcími slinami. K tomuto účelu byly využity metody duální luciferázové eseje, imunosendvičové eseje a western blotu. Ze získaných výsledků vyplývá, že ve virem infikovaných buňkách IC-21 se aktivuje fosfatidyl-inositolová dráha, NF-κB, signální molekula Erk1/2 a další. Testování vlivu klíštěcích slin ukázalo, že jejich účinkem dochází k signifikantnímu snížení aktivity signálních molekul NF-κB, AP-1 a CREB.
|
|
|
Neurobehaviorální následky experimentální psychózy u laboratorních potkanů
Svojanovská, Markéta ; Stuchlík, Aleš (vedoucí práce) ; Telenský, Petr (oponent)
Schizofrenie je závažná duševní porucha, jejíž celoživotní prevalence je kolem 1% a charakteristické je pro ni zhoršení téměř všech psychických funkcí. Její příznaky dělíme na pozitivní, negativní a kognitivní deficit. Psychóza, která také provází schizofrenní onemocnění, je velmi vážným problémem, ovlivňujícím spolu se všemi symptomy jak klinický stav pacientů, tak jejich celkový život. Proto je velká pozornost věnována animálním modelům, které napodobují příznaky této psychózy u zvířat a mohou tak pomoci v osvětlení neurobiologie schizofrenie a v hledání nových antipsychotik. Tato práce se zaměřila na dvoutýdenní subchronickou aplikaci dizocilpinu (MK-801), non- kompetitivního antagonisty NMDA receptorů, potkanům kmene Wistar a Long-Evans, a to ve dvou věkových skupinách od začátku aplikace látky - ve věku PND 30 a PND 60. Po odeznění akutních účinků MK-801 byly studovány neurobehaviorální následky této experimentální psychózy - pomocí testování potkanů v behaviorálních úlohách, a to ve vyvýšeném křížovém bludišti (EPM), v Morrisově vodním bludišti (MWM) a v úloze aktivního vyhýbání se místu na rotující aréně (kolotočovém bludišti). Nakonec byly pomocí Western blotů zhodnoceny změny v expresi NR1, NR2A a NR2B podjednotek glutamátového NMDA receptoru v hipokampu potkanů. Bylo zjištěno, že...
|
|
|
Možné přístupy ke genové terapii Cystické fibrosy
Král, Jan ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
1 Abstrakt Cystická fibróza je autosomálně recesivní onemocnění způsobené mutací v CFTR genu, která má za následek nefunkčnost či absenci CFTR chloridového kanálu. Jeden ze způsobů, jak indukovat tvorbu CFTR proteinu v postižených buňkách, představuje genová terapie. V rámci genové terapie lze do cílových buněk přenášet buď DNA, nebo mRNA. Tato práce byla zaměřena na optimalizaci metody detekce CFTR proteinu pomocí metody Western blot, díky níž byla studována účinnost přenosu CFTR-mRNA do buněčných linií. CFTR protein byl detekován v buněčné linii zdravého plicního epitelu (NuLi-1), plicního epitelu postiženého cystickou fibrózou s mutací ΔF508 (CuFi-1) a v buněčné linii plicního karcinomu (A549). Byla porovnávána účinnost čtyř způsobů buněčné lyze - lyze pomocí ultrazvuku a lyze třemi různými lyzačními pufry. Jako nejúčinnější pro detekci tohoto proteinu se ukázala lyze RIPA pufrem s inhibitory proteas. Zároveň byly porovnávány tři primární monoklonální protilátky pro detekci CFTR proteinu metodou Western blot. Z těchto protilátek se ukázala jako nejvhodnější protilátka CF3, která je specifická proti extracelulárnímu epitopu CFTR proteinu. Byly detekovány různě glykosylované formy CFTR proteinu. Největší množství CFTR protein bylo zjištěno v buněčné linii NuLi-1. Zároveň byl tento protein detekován v...
|
|
|
Exprese inhibičního faktoru migrace makrofágů u neuroblastomových buněčných linií
Polatová, Daniela ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Groh, Tomáš (oponent)
Inhibiční faktor migrace makrofágů (MIF) je cytokin, který se přímo účastní imunitních reakcí organismu vyvolaných vnějším podnětem, např. lipopolysacharidy bakterií nebo glukokortikoidy. Na základě stimulace těmito látkami je MIF uvolňován z makrofágů. Sám aktivuje další makrofágy a T-lymfocyty a umožňuje tak uvolnění protizánětlivých cytokinů. Podílí se též na angiogenezi, neboť endogenně produkovaný MIF je naprosto nezbytný pro proliferaci endoteliálních buněk. K tvorbě nových cév stimulované MIF dochází i u nádorů, což vede k jejich růstu. Přirozeným receptorem pro MIF je integrální membránový protein CD74, který může být vystaven na povrchu buněk. Pokud je vystaven na povrchu T-lymfocytů, může být modifikován chondroitin- sulfátem a interagovat s proteinem CD44, což je důležité k efektivní aktivaci T-buněk. Na komplex CD74-CD44 se poté váže MIF. V rámci této bakalářské práce byla studována přítomnost CD74 v lidských neuroblastomových buněčných liniích UKF-NB-3 a UKF-NB-4. Elektroforézou a následnou metodou ,,Western blot" byla detekována přítomnost CD74 v linii UKF-NB-4, v linii UKF-NB-3 CD74 detekován nebyl. Přítomnost CD74 v neuroblastomových buněčných liniích indikuje, že i neuroblastomy mohou být ovlivňovány MIF. Klíčová slova: MIF, CD74, neuroblastom, tkáňové kultivace, Western blot
|
|
|
Srovnání vlastností buněčných linií rezistentních k ellipticinu, doxorubicinu a cisplatině
Černá, Tereza ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Eckschlager, Tomáš (oponent)
6 Abstrakt Neuroblastom je nejčastější solidní extrakraniální nádor dětského věku. I přes veškeré pokroky v onkologické diagnostice a terapii je léčba některých forem neuroblastomu stále obtížná. Jednou z největších komplikací chemoterapie je vznik lékové rezistence. Tato práce se zabývá vlivem cytostatik na expresi vybraných proteinů, které se mohou podílet na chemorezistenci lidské neuroblastomové buněčné linie UKF-NB-4 na proteinové úrovni i na úrovni genové exprese. Senzitivní linie UKF-NB-4 a od ní odvozené rezistentní linie UKF-NB-4CDDP , UKF-NB-4DOXO a UKF-NB-4ELLI byly vystaveny působení cisplatiny, doxorubicinu nebo ellipticinu po dobu 24, 48 a 72 hodin. Metodou Western blot bylo prokázáno, že cytostatika cisplatina, doxorubicin nebo ellipticin podaná senzitivní neuroblastomové buněčné linii UKF-NB-4 v množstvích, která jsou přidávána do kultivačního média rezistentních neuroblastomových linií pro udržování rezistence, indukují po 72 hodinové kultivaci v této buněčné linii expresi proteinu p53 a zároveň snižují množství retinoblastomového proteinu pRb. Rozdíly v expresi proteinu RAS, cytochromů P450 1A1, 3A4 a cytochromu b5 nebyly prokázány. Změny v expresi studovaných proteinů u rezistentních linií UKF-NB-4CDDP , UKF-NB-4DOXO a UKF-NB-4ELLI kultivovaných s a bez přídavku daného cytostatika nejsou...
|
host ::
RSS.