|
|
Regulation of LAT trafficking to the plasma membrane
Rakhimbekova, Anastasia ; Cebecauer, Marek (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Linker pro aktivaci T buněk je palmitoylovaný transmembránový adaptorový protein, který je exprimován ve většině imunitních buněk, ale ne v nematurovaných a maturovaných B buňkách. Tento protein hraje důležitou roli v aktivaci a maturaci T buněk. LAT je syntetizován v endoplazmatickém retikulu. Cílení linkeru pro aktivaci T buněk do plazmatické membrány je kontrolováno různými determinanty - vlastnostmi transmembránové domény a strukturními motivy v intracelulární části proteinu. Některé z těchto determinantů jsou důležité pro posttranslační modifikaci, export z Golgiho aparátu a je možné cílení do membránových mikrodomén, zatímco jiné interagují s COPII mašinérií a zprostředkují proteinový export z endoplazmatického retikula nebo cílení do endozomů. Klíčová slova: LAT, funkční motivy proteinu, rozřazování proteinů v buněčných membránách, plazmatická membrána, Golgiho aparát
|
|
|
Modulační vliv monovalentních iontů na δ-opioidní receptory
Vošahlíková, Miroslava ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Jakubík, Jan (oponent) ; Kršiak, Miloslav (oponent)
Přesná role opioidních receptorů v drogové závislosti a také modulační mechanizmus, jakým jsou tyto receptory ovlivňovány monovalentními ionty, nejsou doposud zcela vysvětleny. Naše výsledky podporují názor, že mechanizmus závislosti na morfinu je primárně založen na desenzitizaci odpovědi μ- a δ-opioidních receptorů. Desenzitizace nastává již na úrovni funkční aktivity G proteinů. Dlouhodobé vystavení potkanů působení morfinu mělo za následek zvýšení počtu δ-opioidních receptorů a změnu jejich citlivosti vůči sodným iontům. Analýza inhibičního vlivu různých monovalentních iontů na vazbu agonisty v buněčné linii δ-OR-Gi1α (Cys351 -Ile351 )-HEK293 potvrdila preferenční citlivost δ-opioidního receptoru k sodným iontům. Podařilo se nám rozlišit vysoko- a nízkoafinní vazebná místa pro sodné ionty. Biofyzikální analýza interakce iontů lithia, sodíku, draslíku a cesia s plazmatickou membránou buněk HEK293 pomocí fluorescenčních technik ukázala na význam polárních skupin přítomných v povrchové vrstvě membrány. Právě do této oblasti je možné umístit vazebná místa s nízkou afinitou. Klíčová slova: morfin, frontální mozková kůra, opioidní receptory, G proteiny, monovalentní ionty, plazmatická membrána, metody fluorescenční spektroskopie.
|
|
|
Úloha membránového cholesterolu v signalizaci delta-opioidního receptoru Korelace se strukturou plazmatické membrány
Brejchová, Jana ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent) ; Teisinger, Jan (oponent)
Studium buněk linie HEK293 stabilně exprimujících fúzní protein mezi opioidním receptorem typu delta (δ-OR) a mutantou Gi1α proteinu necitlivou vůči působení pertussis toxinu, δ-OR-Gi1α (Cys351 -Ile351 ), poskytlo následující výsledky. Snížení obsahu (deplece) cholesterolu v plazmatické membráně s pomocí cyklického oligosacharidu β-cyklodextrinu nezměnila vazbu specifického agonisty δ-OR, [3 H]DADLE. Ovlivněn nebyl ani celkový počet vazebných míst, ani afinita vazby [3 H]DADLE na receptor. Deplece cholesterolu však narušila schopnost δ-OR aktivovat trimerní G proteiny. Hodnota EC50 agonistou stimulované vazby [35 S]GTPγS se zvýšila o jeden řád. Tento účinek byl pozorován jak v případě kontrolních buněk, tak v případě buněk vystavených účinku pertussis toxinu. To znamená, že deplece cholesterolu významně snížila účinnost funkčního spřažení nejen mezi δ-OR a endogenními G proteiny třídy Gi/Go, které jsou citlivé k působení pertussis toxinu, ale rovněž mezi δ-OR a kovalentně připojeným Gi1α (Cys351 -Ile351 ) proteinem. Nezměněný obsah cholesterolu v plazmatické membráně je tedy důležitou podmínkou správné funkce δ-OR. Stanovení vlivu deplece cholesterolu na funkční aktivitu δ-OR bylo podpořeno analýzou změn biofyzikálních vlastností plazmatické membrány s pomocí fluorescenčních membránových sond,...
|
|
|
Vliv ethinylestradiolu na Na+, K+ - ATPázu
Kettnerová, Karolína ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Driák, Daniel (oponent)
Diplomová práce je zaměřena na studium fyziologického vlivu syntetického estrogenu ethinylestradiolu (EE), který je obsažen v preparátech orálně užívané hormonální antikoncepce. Z velkého množství fyziologicky významných molekul, jejichž exprese či funkce by mohla být EE ovlivněna, se práce zaměřuje na studium vlivu EE na sodíkem a draslíkem aktivovanou adenosintrifosfatázu (Na+, K+ - ATPázu), která je selektivně inhibována kardioaktivními glykosidy, jmenovitě ouabainem (g- strofantinem). Jedná se o významný, membránově vázaný enzym, který katalyzuje aktivní transport sodných draselných přes plazmatickou membránu. Pro tyto účely byla v první části experimentů využita metoda vazby [3H]ouabainu na Na+, K+ - ATPázu. V druhé části experimentu byla pomocí rovnovážné anizotropie DPH studována fluidita plazmatické membrány. Účinek EE na Na+, K+ - ATPázu byl studován jednak v podmínkách in vitro v buněčné linii HEK293 (inkubace 24 hod v živném médiu), tak v podmínkách in vivo po subkutánním podáním samicím potkanů kmene Wistar (10 dní). Výsledky získané při studiu HEK293 buněk ukázaly, že EE zvyšuje specifickou vazbu [3H]ouabainu ve frakcích plasmatických membrán, které byly připraveny flotací v hustotním sacharózovém gradientu. Výsledky účinku EE na vazbu [3H]ouabainu na podbuněčné preparáty (postnukleární...
|
|
|
Cell signalling and molecular complexes of the TRH receptor
Drastichová, Zdeňka
První část disertační práce se zabývá identifikací proteinů isolovaných ve frakci obohacené o plasmatické membrány získané z buněčné linie HEK293-E2M11, jejichž hladina byla změněna po dlouhodobém působení thyroliberinem. Pomocí imunoblotu se specifickými protilátkami proti Na+ ,K+ - ATPase a vazebných pokusů s [3 H]TRH a [35 S]GTPγS bylo zjištěno, že frakce obohacená o plasmatické membrány obsahovala v porovnání s postnukleárním supernatantem výrazně vyšší množství Na+ ,K+ - ATPasy, TRH receptoru and G-proteinů. Pro detekci a identifikaci proteinů ve frakci obohacené o plasmatické membrány, jejichž hladiny byly po dlouhodobém působení TRH (16 h; 10 μM) změněny, byly použity 2D-elektroforéza a hmotnostní spektrometrie. Bylo identifikováno 42 proteinů, z nichž pět proteinů (mitofilin, MTHSP75, prohibitin, stomatin like-2, peroxiredoxin III) představuje mitochondriální proteiny, které jsou důležité pro správnou strukturu a funkci mitochondrií. Hladina těchto proteinů byla zvýšena po dlouhodobém působení TRH, a proto lze usuzovat, že dlouhodobé působení TRH může výrazně ovlivnit mitochondriální membránu a funkci mitochondrií. Druhá část disertační práce se zabývá identifikací molekulárních komplexů TRH receptoru a/nebo Gq/11 proteinu. Pomocí nativní elektroforézy byly identifikovány tři komplexy...
|
|
|
Cell signalling and molecular complexes of the TRH receptor
Drastichová, Zdeňka ; Novotný, Jiří (vedoucí práce) ; Hodný, Zdeněk (oponent) ; Říčný, Jan (oponent)
1 Souhrn První část disertační práce se zabývá identifikací proteinů isolovaných ve frakci obohacené o plasmatické membrány získané z buněčné linie HEK293-E2M11, jejichž hladina byla změněna po dlouhodobém působení thyroliberinu (TRH). Pomocí techniky imunoblotu se specifickými protilátkami proti Na,K-ATPase a vazebných pokusů s [3 H]TRH a [35 S]GTPγS bylo zjištěno, že frakce obohacená o plasmatické membrány obsahovala v porovnání s postnukleárním supernatantem výrazně vyšší množství Na,K-ATPasy, TRH receptoru and G-proteinů. Pro detekci a identifikaci proteinů ve frakci obohacené o plasmatické membrány, jejichž hladiny byly po dlouhodobém působení TRH (16 h; 10 μM) změněny, byly použity 2D elektroforéza a hmotnostní spektrometrie. Bylo identifikováno 42 proteinů, z nichž pět (mitofilin, MTHSP75, prohibitin, stomatin like-2, peroxiredoxin III) představuje mitochondriální proteiny, které jsou důležité pro zajištění správné struktury a funkce mitochondrií. Hladina těchto proteinů byla zvýšena po dlouhodobém působení TRH, a proto lze usuzovat, že dlouhodobé působení TRH může výrazně ovlivnit mitochondriální membránu a funkci mitochondrií. Druhá část disertační práce se zabývá identifikací molekulárních komplexů TRH receptoru a/nebo Gq/11 proteinu. Pomocí nativní elektroforézy byly identifikovány tři komplexy...
|
|
|
Caveolae and caveosoms
Galica, Tomáš ; Forstová, Jitka (oponent) ; Černý, Jan (vedoucí práce)
Kaveoly sú pozoruhodne stabilné štruktúry na plazmatickej membráne. Vytvárajú špecifické domény líšiace sa od zvyšku plazmatickej membrány v lipidovom zložení. Kaveolám sa pripisuje mnoho rôznych funkcií. Sú to napríklad modulácia bunkového povrchu, signalizácia a predovšetkým dobre regulovaná endocytóza. Kaveozómy majú byť veľké vnútrobunkové vezikulárne štruktúry predstavujúce potenciálne nové membránové organely. Odvodené sú od internalizovaných kaveol. Spolu s kaveolami majú predstavovať oddelený systém intracelulárnych vačkov. Nedávne pozorovania však ukazujú, že kaveoly sú schopné fúzovať s endozómami vzápätí po oddelení sa od plazmatickej membrány. Ak je to tak potom môže byť systém odvodený od kaveol, včítane kaveozómov, považovaný za regulérnu súčasť endozomálneho systému. Izolácia kaveozómov od endozómov bola pozorovaná najmä v experimentoch v ktorých bol použitý polyomavírus SV40. Vynára sa teda otázka, či táto izolácia nie je len dôsledkom infekcie SV40. Nedávno sa ukázalo, že SV40 je schopný navodzovať vznik štruktúr podobných kaveozómom aj v neprítomnosti kaveol. V dôsledku týchto zistení sú existencia a vlastnosti kaveozómov spochybňované. Dôležitým problémom je vznik kaveozómov a ich existencia v neprítomnosti SV40. V tejto práci sú zhrnuté princípy, ktoré môžu viesť k vzniku...
|
host ::
RSS.