|
|
Charakterizace centrinů Euglena gracilis a jejich úloha v metabolii
Šmída, Adam ; Hampl, Vladimír (vedoucí práce) ; Pergner, Jiří (oponent)
Euglena gracilis je jednobuněčný volně žijící sladkovodní bičíkovec řadící se do třídy Euglenida (Euglenozoa, Discoba, Excavata). Synapomorfií skupiny Euglenida je jejich pelikula, pevná vrstva pod povrchem buňky, strukturovaná do tenkých proteinových pruhů zvaných pelikulární stripy, které jsou do sebe zakleslé a probíhají pod plazmatickou membránou po celém povrchu buňky. U E. gracilis jsou tyto stripy schopné se navzájem paralelně posouvat, tím dochází ke kontrakci měnící tvar buňky, což vytváří pro eugleny charakteristický peristaltický pohyb zvaný metabolie. Mechanismus tohoto pohybu není objasněn, předpokládá se ale, že se síla generuje v oblasti pod pelikulárním stripem, kde se nachází různé cytoskeletární komponenty jako mikrotubuly či jiná dosud nespecifikovaná cytoskeletární vlákna. Tato práce testuje hypotézu, že za pohybem pelikuly stojí kontrakce pomocí centrinů. Tyto malé proteiny schopné vázat vápenaté ionty jsou evolučně velmi konzervované a účastní se mnoha procesů v eukaryotických buňkách. Mohou být právě také součástí různých kontraktilních struktur protist jako například u nálevníků rodu Vorticella či Paramecium. V transkriptomu E. gracilis byly vyhledány sekvence centrinů a v porovnání s dostupnými daty proteomů pelikuly byl nalezen jediný kandidát. Tento centrin byl úspěšně in...
|
|
|
Cellular determinants of the distribution of PIN auxin transporters in the plasma membrane
Stelate, Ayoub ; Petrášek, Jan (vedoucí práce) ; Mravec, Jozef (oponent) ; Nodzynski, Tomasz (oponent)
Asymetrická lokalizace přenašečů auxinu vždy přitahovala pozornost mnoha vědců po celém světě. Zabývat se tímto tématem se zaměřením na plazmatickou membránu (PM) však vyžaduje pokročilé mikroskopické techniky a znalosti biofyziky a biologie. Tato doktorská práce propojuje tyto dvě disciplíny aby přispěla k našemu pochopení dynamiky a distribuce přenašečů auxinu PIN-FORMED z tabáku (NtPINs) v PM. Vyvinul jsem novou metodu korelační světelné a elektronové mikroskopie (CLEM) s využitím fluorescenční mikroskopie s totálním vnitřním odrazem (TIRFM) a pokročilé environmentální skenovací elektronové mikroskopie (A- ESEM). Pokud je mi známo, jedná se o první pokus o dosažení korelace mezi imunofluorescenčním a elektronovým mikroskopickým zobrazením integrálních PM proteinů u rostlin. Jak jsem ukázal, jednotlivé NtPINs jsou v PM uspořádány různě. Dynamické analýzy, které kvantifikují rychlost difuze jednotlivých nanodomén, mi umožnily ukázat, že NtPINs mají do různí míry omezenou pohyblivost a jejich rychlost difúze se liší. Zkoumal jsem roli buněčné stěny a cytoskeletu v organizaci a dynamice NtPINs. Pomocí farmakologického ošetření jsem ukázal, že rozdílně ovlivňují jejich mobilitu a organizaci v PM, kdy úplné odstranění buněčné stěny vykazuje významné změny v distribuci nanodomén NtPINs ve srovnání s...
|
|
|
LINC complex: The link between chromatin integrity and sperm motility
Šanovec, Ondřej ; Komrsková, Kateřina (vedoucí práce) ; Lánská, Eva (oponent)
LINC komplex (z angl. Linker of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton) je multiproteinová struktura nacházející se v jaderné membráně, která propojuje cytoskelet s jaderným skeletem. Jedná se o velmi konzervovaný komplex, který se nachází v každé savčí buňce, včetně gamet. Zde je ovšem LINC komplex velice variabilní a sestává se z různých proteinových partner, které mají specifickou lokalizaci. Zároveň se jedná o oblast, oproti somatickým buňkám, málo prozkoumanou. Tato práce se zabývá rolí LINC komplexu během spermiogeneze na myších modelech. Použit byl divoký typ a myší linie s delecí Protaminu 2 (Prm2-/- ). Protaminy jsou male proteiny, které nahrazují histony během spermiogenese. Myší model použitý v této studii, vytvořený týmem profesora Huberta Schorle, má deleci v exonu 1 genu Prm2. Důsledkem této delece mají takto ovlivněné myši překvapivý fenotyp, který zahrnuje úplnou ztrátu motility spermií. Na základě těchto pozorování byla vytvořena hypotéza, že LINC komplex může být zodpovědný za špatnou komunikaci mezi hlavičkou a bičíkem spermie, což vede ke ztrátě pohyblivosti. Výsledky ovšem naznačují, že LINK komplex není ztrátou Prm2 ovlivněn. Získaná data ovšem naznačují, že by v Prm2-/- spermiích mohla být narušena dynamika aktinu, aktivita cytoskeletálních motorů nebo tubulin acetylázy / histon...
|
|
|
Mechanizmus chybného formování spojení hlavičky a bičíku u acefalických spermií s nedostatečnou tvorbou centrobinu
Vlčková, Monika ; Frolíková, Michaela (vedoucí práce) ; Krejčová, Tereza (oponent)
Syndrom acefalických spermií (ASS) je vzácnou formou teratozoospermie, která je pravděpodobně genetického původu. Spermie jedinců s tímto syndromem mají poškozený aparát spojující hlavičku a bičík (HTCA), což vede ke vzniku acefalických spermií tzn. spermií s oddělenými hlavičkami od bičíků. Jedinci postižení ASS jsou téměř výhradně neplodní. Jedním z proteinů, jehož mutace způsobuje ASS, je SUN5. Proteiny SUN jsou společně s KASH proteiny součástí tzv. LINC komplexu, který zajišťuje spojení nukleoskeletu s cytoskeletem. Centrobin je protein podílející se na duplikaci centriol a sestavení dělícího vřeténka. Potkani nesoucí poškozený gen pro Centrobin mají sníženou fertilitu a vykazují fenotyp ASS. Z toho důvodu byl tento modelový organismus v této práci využit pro studium možných vzájemných vazeb proteinů podílejících se na vzniku ASS. Vzhledem k podobnému fenotypu spermií s mutovaným centrobinem a SUN5, existuje možnost, že centrobin interaguje s některým z proteinů LINC komplexu a společně se podílejí na vytvoření spojení hlavičky a bičíku. Spermie potkanů s poškozeným genem pro Centrobin vykazují rovněž značné poškození bičíků. U pacientů s ASS byla dříve popsána snížená exprese proteinu Odf1 a myší Odf1-deficientní samci jsou neplodní v důsledku dekapitace. V této práci jsme se proto zaměřili i...
|
|
|
Role aktinového cytoskeletu při umisťování auxinových přenašečů v plazmatické membráně.
Kebrlová, Štěpánka ; Petrášek, Jan (vedoucí práce) ; Pernisová, Markéta (oponent)
Auxin hraje významnou morfogenní roli ve vývoji rostlin, zejména díky jeho účinku na genovou expresi, ale i řadu rychlejších dějů, které jsou přímo závislé na jeho koncentraci. Proto je v mnoha rostlinných pletivech směrovaný transport auxinu, zajišťovaný specifickými přenašeči v plazmatické membráně, důležitý pro koordinaci morfogenních stimulů. Množství auxinových přenašečů v plazmatické membráně přímo ovlivňuje výslednou koncentraci auxinu uvnitř buňky. Ačkoliv se dá předpokládat, že lokalizace auxinových přenašečů a jejich množství v plazmatické membráně jsou určovány především aktinovým cytoskeletem a jeho zapojením v procesech váčkového transportu, není v současné době tento vztah stále vyjasněn. Proto nás v této práci zajímalo, jak je lokalizace a funkce auxinových přenašečů ovlivněna v případě, že je v daném buněčném typu postižena funkce aktinového cytoskeletu. K tomuto účelu byla studována lokalizace auxinových přenašečů PIN3, PIN4, PIN7 a AUX1 v pokožkových buňkách velmi mladých děložních listů Arabidopsis thaliana, jejichž morfogeneze byla postižena mutacemi v podjednotkách aktinového nukleačního komplexu ARP2/3. Byly připraveny kříženci mutantů v podjednotkách komplexu ARP2/3 s markerovými liniemi nesoucí fluorescenčně označené auxinové přenašeče a sensory auxinem řízené genové...
|
|
|
Role posttranslačních modifikací tubulinu v regulaci mikrotubulárních procesů
Šliková, Pavlína ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Libusová, Lenka (oponent)
Mikrotubulární cytoskelet hraje zásadní roli v nejrůznějších buněčných pochodech, jako je vnitrobuněčný transport, buněčná motilita či segregace chromosomů při buněčném dělení. Tubulin, stavební jednotka mikrotubulů, prochází mnohými posttranslačními modifikacemi, které ovlivňují dynamiku mikrotubulů, jejich organizaci a interakci s dalšími proteiny. Porozumění tomu, jakou roli posttranslační modifikace hrají v zajištění rozmanitých funkcí a vlastností mikrotubulů, je klíčové k pochopení dynamiky mikrotubulárního cytoskeletu jako celku. Přesné mechanismy, jakými posttranslační modifikace na mikrotubulární cytoskelet působí, však nejsou zcela objasněny. V této práci byl zkoumán vliv přítomnosti posttranslačních modifikací na růst mikrotubulů a na jejich interakci s motorovým proteinem kinesinem-1. Pomocí fluorescenční mikroskopie s úplným vnitřním odrazem a interferenční reflekční mikroskopie bylo zjištěno, že vysoká míra posttranslačních modifikací na mikrotubulech snižuje délku jejich interakce s kinesinem, zatímco afinita kinesinu k mikrotubulům a průměrná rychlost, kterou se po nich pohybuje, se u vysoce a málo modifikovaných mikrotubulů významně neliší. Dále bylo zjištěno, že absence polyglutamylace na podjednotkách tubulinu vede k rychlejší polymerizaci mikrotubulů. Tyto výsledky ukazují, že...
|
|
|
Structural and functional studies of signaling molecules in axon guidance
Knapp, Kryštof ; Rozbeský, Daniel (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent)
V této práci jsme se zaměřili na studium autoinhibičního mechanismu proteinů z rodiny MI- CAL pomocí biochemických, biofyzikálních a bioinformatických metod. MICAL proteiny patří do skupiny flavinových monooxygenas a sehrávají nezbytnou roli v řadě buněčných pro- cesů zejména skrze regulaci dynamiky cytoskeletonu. MICAL-1 je dlouhodobě studován pro svou roli v mechanismu navádění axonu jako efektor repulzivně signalizačních drah, kde pů- sobí destabilizaci aktinových vláken pomocí své oxidační aktivity. Nedávno zveřejněné studie poukazují na to, že MICAL-1 může působit také jako signalizační molekula skrze lokalizo- vanou produkci peroxidu vodíku, která reguluje funkci dalších proteinů. Navzdory tomu, že je dlouhodobě zřejmé, že aktivita MICAL-1 proteinu musí být přísně regulována, přesný mechanismus této regulace dosud není znám. Na základě studia reakční kinetiky a simu- lací molekulové dynamiky MICAL-1 proteinu z křepelky japonské a jeho zkrácené verze bez C-terminální domény, předkládáme nový model pro autoinhibiční mechanismus MICAL-1 proteinů. Domníváme se, že regulace aktivity MICAL-1 proteinů je zprostředkována skrze interakci mezi C-terminální a monooxygenasovou doménou, která brání plné katalytické ak- tivitě. Dále předkládáme důkazy o tom, že regulace aktivity proteinu není ovlivněna...
|
|
|
Mechanisms of symmetry breaking during embryogenesis
Ždímalová, Michaela ; Lánský, Zdeněk (vedoucí práce) ; Búran, Peter (oponent)
Narušenie pravo-ľavej symetrie je dôležitá súčasť správneho vývinu tela mnohých orga- nizmov, vrátane ľudí. Skutočnosť, že pravo-ľavá asymetria je ustanovená vo všetkých jedincoch daného druhu v konzistentnom smere, fascinuje vedcov už dlhý čas. Aj keď niekoľko navrhnutých alebo už všeobecne prijímaných modelov popisuje mechanizmus tohto deja, väčšina z nich buď nepokrýva všetky prípady alebo ich molekulárny mechaniz- mus nie je preskúmaný do hĺbky. Výraznú pozornosť získava v súčasnej literatúre model akto-myozínových tokov, ktoré sú poháňané rotujúcim pohybom vznikajúcim v akto- myozínovom kortexe. Táto práca predstavuje problematiku akto-myozínových tokov, ako aj poskytuje prehľad o predchádzajúcom výskume. Keďže pravo-ľavá asymetria úzko súvisí s chiralitou na rôznych úrovniach, v tejto práci sú tiež diskutované súčasné znalosti o možnom procese prenosu chirality z molekúl na vyššiu úroveň. 1
|
|
|
Orientovaný růst buněk mimo nervovou soustavu v modelovém organismu Caenorhabditis elegans
Smidžárová, Lucie ; Macůrková, Marie (vedoucí práce) ; Strouhalová, Kateřina (oponent)
1 Abstrakt Orientovaný růst buněk je důležitým procesem pro správný vývoj tkání, při kterém dochází k regulovaným změnám buněčných tvarů. Důležitou roli v tomto mechanismu hraje remodelace cytoskeletálních elementů v rostoucích částech buňky, která je regulována mnoha extracelulárními i intracelulárními faktory. Tato práce se zabývá orientovaným růstem buněk mimo nervovou soustavu u modelového organismu Caenorhabditis elegans, konkrétně růstem vylučovací kanálové buňky a invazí buňky kotevní. Mechanismus růstu vylučovací buňky se částečně podobá růstu neuronů, navíc však obsahuje jedinečný mechanismus růstu prostřednictvím zvětšování intracelulárního lumen. V případě kotevní buňky růstové mechanismy podporují porušení bazální membrány a invazivní chování podobné chování rakovinných buněk. Mechanismy růstu těchto buněk tak mohou sloužit i jako model pro některé lidské patologie jako jsou cystická onemocnění ledvin, nebo metastázy rakovinných buněk, a proto by další studium v této oblasti mohlo vést k získání nových poznatků o těchto nemocech. Na konci práce jsou dále stručně popsány další non-neuronální buňky modelového organismu C. elegans, u nichž se orientovaný růst objevuje. Klíčová slova: růst buněk, vylučovací kanálová buňka, kotevní buňka, signalizace, cytoskelet
|
|
|
Computational Simulation of Mechanical Behaviour of Endothelial Cells
Jakka, Veera Venkata Satya ; Gumulec, Jaromír (oponent) ; Majer, Zdeněk (oponent) ; Matsumoto,, Takeo (oponent) ; Burša, Jiří (vedoucí práce)
Atherogenesis is the leading cause of death in the developed world, and is putting considerable monetary pressure on health systems the world over. The prevailing haemodynamic environment together with the local concentration of mechanical load play an important role in the focal nature of atherosclerosis to very specific regions of the human vasculature. In blood vessels, the endothelium, a thin monolayer of cells, lies at the interface between the bloodstream and the vascular wall. Dysfunction of endothelial cells is involved in major pathologies. For instance, atherosclerosis develops when the barrier and anti-inflammatory functions of the endothelium are impaired, allowing accumulation of cholesterol and other materials in the arterial wall. In cancer, a key step in the growth of a tumour is its vascularization, a process driven by endothelial cell migration. The mechanical environment of endothelial cells plays a key role in their function and dysfunction. Computational modelling can enhance the understanding of cell mechanics, which may contribute to establishing structure-function relationships of different cell types in different states. To achieve this, finite element (FE) models of endothelium cell are proposed in this thesis, i.e. a suspended cell model and adherent model elucidating the cell’s response to global mechanical loads, such as tension and compression, as well as a model of the cell with its natural shape inside the endothelial layer. They keep the central principles of tensegrity such as prestress and interplay between components, but the elements are free to rearrange independently of each other. Implementing the recently proposed bendo-tensegrity concept, these models consider flexural (buckling) as well as tensional/compressional behaviour of microtubules (MTs) and also incorporate the waviness of intermediate filaments (IFs). The models assume that the individual cytoskeletal components can change their form and organization without collapsing the entire cell structure when they are removed and thus, they enable us to evaluate the mechanical contribution of individual cytoskeletal components to the cell mechanics. The proposed models are validated with experimental results by comparison of their force-displacement curves. The suspended cell model mimics realistically the force-deformation responses during cell stretching and compression, and both responses illustrate a non-linear increase in stiffness with mechanical loads. The compression test of flat endothelial cell is simulated and compared with adherent cell test and its simulation. Then, the shear test of flat cell is simulated to assess its shear behaviour occurring in vascular wall due to blood flow. Then investigated the mechanical response of the flat cell within the endothelium layer under physiological conditions in arterial wall. Later, investigated the cell response in debonding during cyclic stretches using 3-D finite element simulations. The proposed models provide valuable insights into the interdependence of cellular mechanical properties, the mechanical role of cytoskeletal components in endothelial cells individually and synergistically, and the nucleus deformation under different mechanical loading conditions. Therefore, the thesis should contribute to the better understanding of the cytoskeletal mechanics, responsible for endothelial cell behaviour, which in turn may aid in investigation of various pathological conditions related to
|
host ::
RSS.