|
|
Využití mikroskopie atomárních sil ke studiu vybraného bakteriálního kmene
Nováková, Simona ; Slaninová, Eva (oponent) ; Smilek, Jiří (vedoucí práce)
Předmětem bakalářské práce bylo studium vybraných bakteriálních kmenů prostřednictvím mikroskopie atomárních sil. Zkoumány byly termofilní purpurové bakterie – Rhodobaca Barguzinensis, Rhodoblastus acidophilus. Hlavním cílem bylo optimalizovat vybranou mikroskopickou metodu pro zobrazení ve vodném prostředí s nejvhodnějším výběrem fixace vzorku. Pro studium bakteriálních kmenů bylo nutné zachovat viabilitu buněčných mikroorganismů a dodržet optimální podmínky pro zachování nativního stavu při procesu měření. Dále byly vyhodnoceny mechanické vlastnosti – Youngův modul a adheze. Morfologie jednotlivých vzorků byla srovnávána u vzorků stejného druhu v odlišném pH kapalného prostředí a v prostředích s různou koncentrací rozpuštěné soli NaCl. Cíleno bylo i na schopnost produkce PHA granulí u purpurových bakterií, ovšem kvůli absenci PHA-syntázy první třídy nebylo PHA detekováno. Byly porovnány vlivy různých parametrů kultivace jako odlišná doba kultivace či rozdílné pH prostředí. Snímkování bakterií probíhalo pomocí hrotu SNL-10, který je vhodný pro bakteriální vzorky v kapalném prostředí a samotné měření probíhalo v módu QITM. K imobilizaci byl použit skleněný substrát pokrytý vrstvou Poly-L-lysinu. Na závěr byly vyhodnoceny mechanické vlastnosti prostřednictvím Youngova modulu a adheze u vzorků s různě proměnlivými faktory prostředí.
|
|
|
Screening růstu Rhodospirillum rubrum pomocí mikrokalorimetrie
Vetchý, Antonín ; Slaninová, Eva (oponent) ; Krouská, Jitka (vedoucí práce)
Předložená práce se zabývá studiem růstu bakterie Rhodospirillum rubrum pomocí mikrokalorimetrie. Teoretická část se věnuje charakterizaci zkoumaného mikroorganismu a popisu hlavní měřící metody. Pro měření byly zvoleny dva kmeny zmíněné bakterie – divoký kmen (wild type) a mutantní kmen s delecí genu pro PHA syntázu. Nejprve byla provedena optimalizace podmínek měření, kdy byly např. zkoumány různé hodnoty výchozí optické hustoty. Hlavním cílem práce bylo porovnání růstu obou kmenů R. rubrum na různých substrátech lišících se zdrojem uhlíku. K porovnání byly využity křivky normalizovaného tepelného toku získané pomocí mikrokalorimetrie a růstové křivky změřené pomocí tradiční spektrofotometrické metody. Závěrem práce bylo nastavení replikovatelných podmínek měření, které poskytly porovnatelné výsledky pro oba kmeny bakterie. Nejvhodnějším médiem pro nárůst biomasy obou kmenů bakterie Rhodospirillum rubrum se jeví médium SYN FAY, naopak nejméně vhodným se jeví médium SYN AY obsahující acetát, u kterého byly pozorovány jeho částečné inhibiční účinky na růst bakterie. Výsledky analýzy pomocí mikrokalorimetru byly dále potvrzeny a rozšířeny pomocí měření růstových křivek na ELISA readeru.
|
|
|
Stanovení viability u rhizobakteriálních kultur
Svobodová, Lucie ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato závěrečná práce je zaměřena na studium viability rhizobakterií podporující růst rostlin (PGPR). Viabilita byla stanovována u tří kmenů bakterie Azotobacter vinelandii, a to CCM 289, DSM 87 a DSM 720 pomocí průtokové cytometrie s fluorescenční sondou PI, SYTOXTM Blue a DAPI, a to po 120 a 72 hodinách kultivace. Byla provedena optimalizace vhodné fluorescenční sondy pro daný kmen, kdy jako nejvhodnější se jevilo použití sondy PI pro kmen CCM 289. Pro kmeny DSM 87 a DSM 720 lze použít sondy PI a SYTOXTM Blue. Pro následující experimenty byl vybrán kmen DSM 87, který byl podroben vlivu různých síťovacích činidel. Pomocí průtokového cytometru a barvení fluorescenční sondou PI byla ověřována viabilita po aplikaci roztoků chloridu vápenatého, barnatého, měďnatého, železitého, hlinitého a síranu vápenatého o koncentraci 2, dále 0,2 a 0,02 hm. % ke kultuře. Roztoky chloridu vápenatého, barnatého a síranu vápenatého neměly významný vliv na viabilitu buněk. Naopak při použití chloridu železitého byl zjištěn trend, kdy s klesající koncentrací roztoků ubývalo odumřelých buněk. Tohoto jevu bylo docíleno i při použití chloridu hlinitého a měďnatého, u kterých však použití nejkoncentrovanějšího roztoku mělo za následek inaktivaci většího počtu buněk než v předchozím případě, u chloridu hlinitého došlo ke ztrátě viability většiny přítomných buněk. Viabilita byla ověřována také u buněk uvolňovaných z připravených gelů. Pro experimenty byly zvoleny roztoky výše zmíněných síťovacích činidel o koncentraci 2 hm. %, za experimentálně stanovených podmínek byla kultura podrobena gelaci. Část gelů byla následně ponechána ve fosfátovém pufru, aby došlo ke zpětnému uvolnění buněk. Pro toto snazší uvolňování byl přidán enzym algináza, jehož účinkem je rozkládání alginátu. Bylo zjištěno, že koncentrace 2 hm. % vybraných síťovacích činidel neměla vliv na viabilitu buněk, tedy že buňky uvolněné z gelu se se jevily jako viabilní.
|
|
|
Příprava nanočástic a nanovláken s obsahem antimikrobiálních látek
Kubišová, Veronika ; Slaninová, Eva (oponent) ; Skoumalová, Petra (vedoucí práce)
Tato diplomová práce pojednává o problému, kterým je nedostatečná současná terapie ran a představuje řešení v podobě krytů ran na bázi nanomateriálů. Konkrétně je zaměřena na vývoj a charakterizaci různých nanovlákenných materiálů s integrovanými liposomovými částicemi, které by mohly sloužit jako zdroj terapeutických látek a být využitelné právě v oblasti terapie ran. Rešerše v úvodní části práce byla nejprve zaměřena na zmíněný problém, kterým jsou nedostatky stávajících konvenčních obvazových materiálů. Nebyl opomenut ani popis lidské kůže z anatomického a funkčního hlediska, a ani samotný proces hojení ran. Představeny byly i různé typy krycích materiálů. Velká část však byla zaměřena na nanomateriály a jejich využití právě v oblasti terapie kožních poranění. Zmíněnými nanomateriály byly především liposomové částice a nanovlákna, neboť experimentální část práce byla zaměřena právě na tyto struktury. Popis se zabýval jak samotnou charakteristikou těchto struktur, tak i biopolymery použitelnými k jejich přípravě. Cílem však byla příprava nanovláken o obsahu liposomů, proto byl popsán způsob tvorby takových systému. Nedílnou součástí krycích materiálů jsou také různá terapeutika, zejména taková, která potlačí vznik infekce a sníží bolest v ráně, rešerše byla proto zaměřena na antibiotikum ampicilin a analgetikum ibuprofen. Experimentální část byla věnována samotné problematice výroby nanovláken s liposomy a také kvalitativnímu prokázání přítomnosti liposomů v elektrostaticky připravovaných nanovláknech. Vybranými polymerními složkami těchto systémů byl polyhydroxybutyrát (PHB) a želatina. Nanovlákna a liposomové částice (i kombinované liposomy s PHB) byly však nejprve připraveny v samotné formě a charakterizovány zejména z hlediska postupného uvolňování léčivých látek. Získané výsledky byly pak porovnány s výsledky dodávání terapeutik prostřednictvím kombinovaných nanovlákenných struktur s liposomy. U těchto kombinovaných struktur bylo cílem dosáhnout synergie v oblasti dodávání léčiv mezi těmito systémy. Snahou práce bylo vytvořit kryt z biomateriálů s řízeným uvolňováním léčiv. Léčivy obsaženými v těchto materiálech byl již zmíněný ampicilin a ibuprofen. Důležitou součástí práce bylo pak stanovení bezpečnosti připravených materiálů, testovány byly z hlediska cytotoxicity, kdy provedeným testem byl MTT test a LDH test. A samotná schopnost nanovláken v oblasti hojení ran byla pak sledována v rámci scratch testu neboli testu „hojení ran“. Na závěr práce jsou uvedena doporučení pro další práce, které na toto téma budou navazovat.
|
|
|
Study on metabolism of polyhydroxybutyrate and glycogen in cyanobacteria
Drinka, Jakub ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
The submitted diploma thesis is focused on establishing a quantification method for glycogen analysis in cyanobacterial cells in order to be able to consider the impact of illumination and other parameters on accumulation of reserve polymers, glycogen and polyhydroxyalkanoates (PHA), namely poly(3-hydroxybutyrate) (PHB). The experiments were conducted with two cyanobacterial species, Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechocystis salina CCALA 192, which were grown both in Erlenmayer flasks (EF) and multicultivator (MC). The methodology for glycogen accumulation was introduced based on available literature and conducted optimalization. The effect of different illumination conditions was observed in a nitrogen-limiting media M22O, in which half of the cultures were cultivated with a 16 hours of light and 8 lights of darkness periods (EF) for the whole duration of the experiment. Others were transfered into full-time dark period after entering the dormant chlorosis state, following the exhaustion of nitrogen levels in the media. Synechocystis sp. PCC 6803 showed a decrease in both of the reserve polymers accumulation when introduced to this type of stress conditions. On the other hand, Synechocystis salina CCALA 192 converted some of the glycogen into PHB in the dark, but the polyester levels were lower than those of the cultures continuously cultivated under the lamp. A negative effect on the biomass concentration was also detected, while cyanobacterial pigments seemed to be unaffected by the lack of light, their levels in the EF that remained illuminated decreased due to chrolosis. The experiments in the MC were conducted in the same way, but the light period consisted of constant, 24-hour illumination. Synechocystis sp. PCC 6803 seemed to follow a different trend than in cultivations in EF, the PHB concentration was not affected by the dark period and remained on the same amounts, while glycogen was metabolised. Synechocystis salina CCALA 192 increased its polyester reserves in the darkness and in comparison with the first species accumulated almost 4 times more PHB. However, the results acquired from cultivations in MC seemed to be very unequal due to a lot of small differences in the cultivation conditions. That was the reason why in the later stages of experiments they were focused more on a possible PHA copolymer formation, rather than comparing the functions of these two reserve polymers in the light/dark cycles. However, none of the cultivations was succesful in this matter and no monomer other than 3-hydroxybutyrate (3HB) was detected in the dried biomass.
|
|
|
Využití fyzikálně-chemických analýz při studiu stresových odpovědí mikroorganismů
Slaninová, Eva ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá využitelností fyzikálně-chemických analýz při vlivu stresových faktorů na mikroorganismy, kde hlavní náplní této práce bylo navržení a následná optimalizace technik a metod, které jsou obecně využívány v odlišných oblastech vědy a výzkumu. Jako modelové mikroorganismy, podrobené fyzikálně-chemickým analýzám v experimentální části této práce, byly zvoleny dva bakteriální kmeny: Cupriavidus necator H16 a její mutantní kmen Cupriavidus necator PHB-4 lišící se schopností produkce polyhydroxyalkanoátů. Nejprve byly navrženy a otestovány mikroskopické techniky jako transmisní elektronová mikroskopie (TEM), kryo skenovací elektronová mikroskopie (kryo-SEM) a mikroskopie atomárních sil (AFM) sloužící k charakterizaci morfologických odlišností bakterií. Dále byly stanovovány a porovnávány viskoelastické vlastnosti bakterií prostřednictvím oscilačních testů metodou reologie, které byly rovněž otestovány a optimalizovány s ohledem na typ vzorků. Mezi další navržené a otestované fyzikálně-chemické metody patří termická analýza, konkrétně diferenční skenovací kalorimetrie (DSC) a termogravimetrická analýza (TGA) zabývající se transportem vody a chování intracelulární vody s ohledem na vliv přítomných PHB granulí v bakteriích. Poslední technika, která byla zavedena a optimalizována, je použití dynamického a elektroforetického rozptylu při měnícím se pH, sloužící k charakterizaci povrchových vlastností bakterií (velikost, zeta potenciál, izoelektrický bod).
|
|
|
Studium struktury a vlastností vody v blízkosti hydrofilních povrchů
Slaninová, Eva ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce je zaměřena na studium vlivu hydrofilních povrchů na strukturu a vlastnosti vody. Zejména se zaměřuje na nové experimentální poznatky ohledně anomálií chování vody v blízkosti hydrofilních povrchů, kde dochází k tvorbě tzv. exkluzních zón. Exkluzní zóny byly studovány za pouţití modelové hydrofilní vrstvy (Nafion), a to z hlediska rychlosti jejich vzniku, vlivu přídavku iontů a polárních látek a studia struktury vody v hydratované hydrofilní membráně pomocí infračervené spektroskopie.
|
|
|
Využití techniky AFM při studiu biologických vzorků
Khýrová, Markéta ; Smilek, Jiří (oponent) ; Slaninová, Eva (vedoucí práce)
Předmětem bakalářské práce bylo studium Gram-negativních bakterií se schopností akumulovat polyhydroxyalkanoáty pomocí mikroskopie atomárních sil. V rámci experimentální části práce byly zkoumány bakteriální kmeny Cupriavidus necator H16 a jeho mutantní kmen Cupriavidus necator PHB-4, Rhodospirillum rubrum a Halomonas halophila. Konkrétním cílem bylo optimalizovat tuto mikroskopickou metodu pro výzkum jak bakterií na vzduchu, tak živých bakterií v jejich přirozeném prostředí. Optimalizace byla provedena s ohledem na jednoduchost, časovou náročnost a reprodukovatelnost provedení měření. Pro měření na vzduchu byla zvolena imobilizace 10× zředěné bakteriální suspenze vysušením na skleněném substrátu. Skenování bylo provedeno pomocí hrotu TESPA-V2 se sníženou konstantou tuhosti v QITM módu. V rámci měření bakteriálních vzorků v kapalině byly zkoumány různé postupy imobilizace bakterií na skleněném substrátu pomocí Poly-L-lysinu a Poly(ethyleniminu). Jako nejvhodnější fixace byla zvolena metoda s využitím Poly-L-lysinu. Pro měření v QITM módu v kapalném prostředí byly voleny hroty MLCT – A nebo SNL – B s konstantou tuhosti okolo 0,1 N/m. Nakonec byl proveden pokus o zisk informací o adhezi a Youngově modulu vysušených i živých bakterií s ohledem na předpokládané ovlivnění mechanických vlastností buněk s rozdílným obsahem polyhydroxybutyrátu u bakteriálních kmenů Cupriavidus necator H16 a Cupriavidus necator PHB-4.
|
|
|
Stresová odolnost bakteriálních monokultur a směsných kultur
Chorvátová, Michaela ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
V tejto bakalárskej práci bola skúmaná stresová odolnosť bakteriálnych monokultúr a definovanej zmiešanej kultúry. Teoretickú časť predstavuje literárna rešerš, ktorá sa zaoberá všeobecnou stresovou odolnosťou baktérií a dynamikou ich rastu. Ďalej sú predstavené polyhydroxyalkanoáty, ich zapojenie do stresovej odpovede baktérií a významná moderná metóda akou je prietoková cytometria, ktorá predstavovala dôležitú súčasť experimentu. V experimentálnej časti bola študovaná odolnosť voči osmotickému a teplotnému stresu. Pre tento účel boli použité monokultúry PHA akumulujúceho kmeňa Cupriavidus necator H16 a mutantného kmeňa Cupriavidus necator H16/PHB-4 neschopného akumulácie PHA. Definovaná zmiešaná kultúra bola pripravená kokultiváciou týchto dvoch kmeňov. Celkovo možno konštatovať, že akumulácia a utilizácia PHA, konkrétne poly(3-hydroxybutyrátu), zvýšila odolnosť baktérií, čo sa najviac prejavilo u osmotického stresu, kedy koncentrácie soli nespôsobili výraznejšie zníženie viability u Cupriavidus necator H16 oproti mutantnému kmeňu, ktorého viabilita klesala s rastúcou intenzitou stresu. Experimentálne teploty naopak nepredstavovali výrazný vplyv na viabilitu buniek, pričom sa takmer vždy potvrdilo, že baktériám sa najviac darilo pri ich teplotnom optime 30 °C.
|
|
|
Studium akumulace polyhydroxyalkanoátů u cyanobakterií
Pacasová, Viktorie-Alexandra ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená bakalářská práce je zaměřená na studium vlivu vybraných stresových faktorů na produkci PHB u kmenů cyanobakterií Synechocystis sp. PCC 6803 a Synechocystis salina CCALA 192. Cyanobakterie byly kultivovány v multikultivátoru a jako stresový faktor byl použit zvýšený obsah soli (chloridu sodného) nebo směs acetátu a -butyrolaktonu v kultivačním médiu. Obsah PHB v jednotlivých cyanobakteriích byl stanovován pomocí plynové chromatografie, přítomnost a množství barviv byla stanovována pomocí extrakce barviv a pomocí přímé spektrofotometrické analýzy. Získané výsledky nepotvrdily hypotézu o zvýšení produkce PHB při kultivaci cyanobakterií v prostředí se zvýšeným obsahem soli. Příčinou tohoto zjištění je pravděpodobně společné působení několika stresových faktorů jako zvýšený obsah soli, kontinuální osvětlení v multikultivátoru a limitace dusíkem, díky použitému typu média, na kultury Synechocystis salina CCALA. Při kultivaci se směsí acetátu a -butyrolaktonu byly kultury analyzovány stejným způsobem, jako v případě prostředí se zvýšeným obsahem soli, a byla stanovována i přítomnost kopolymeru 3-hydroxybutyrátu a 4-hydroxybutyrátu. Během této kultivace byl rovněž pozorován pozitivní vliv kombinace působení kontinuálního osvětlení, typu média limitujícího dusík a výchozí koncentrace buněk v kulturách na rychlost růstu vybraných kmenů cyanobakterií.
|
host ::
RSS.