|
|
Příprava neprosinu I - unikátní kyselé proteasy s potenciálem pro použití ve strukturní biologii, proteomice a terapii glutenových intolerancí.
Pelechová, Kamila ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Šmídová, Aneta (oponent)
Proteasy se vyskytují napříč všemi říšemi, od virů a mikroorganismů po rostliny a živočichy, včetně lidí. Pro živé organismy jsou nezbytné. Degradují proteiny na peptidy a jednotlivé aminokyseliny, což umožňuje organismům lépe vstřebávat živiny. Zároveň plní funkci regulátoru - kontrolují buněčný cyklus, jsou zodpovědné za přeměnu prekurzorů na biologicky aktivní látky, jsou součástí signalizačních kaskád. Díky svým vlastnostem jsou proteasy využívány pro terapeutické účely a nalézají uplatnění i v průmyslu a výzkumu. Tato práce se zabývá produkcí rekombinantně připraveného neprosinu - nově objevené prolyl-endopeptidasy izolované z masožravých rostlin Nepenthes ventrata. Jedná se o kyselou proteasu s potenciálem pro využití ve strukturní biologii, proteomice a medicíně. Díky své schopnosti štěpit především C-koncové prolinové zbytky se neprosin stává slibnou možností pro enzymovou terapii celiakie.
|
|
|
Příprava a využití proteas vhodných ke studiu struktury proteinů.
Jirečková, Barbora ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Vaňková, Pavla (oponent)
Vodík/deuteriová výměna spojená s hmotnostní spektrometrií (HDX-MS) je metoda, která umožňuje studium struktury a dynamiky proteinů. Pro lokalizaci této výměny je do HDX-MS zařazena proteolýza analyzovaného proteinu, která určuje prostorové rozlišení. Standardně se používá pepsin, který má ale své limitace, a také štěpení pouze jednou proteasou často neposkytuje optimální prostorové rozlišení. V několika publikacích byl akcentován význam alternativních proteas nepenthesinu-2 (Nep-2) a aspergillopepsinu (XIII), které oproti pepsinu štěpí za bazickými aminokyselinami. Při studiu na prolin bohatých proteinů získává význam prolyl endoproteasa z Aspergillus niger (AnPEP). Tato práce se zabývá charakterizací imobilizovaného AnPEPu v kombinaci s proteasami pepsinem, aspergillopepsinem nebo Nep-2 za účelem jejich aplikace v HDX-MS. Nejprve byly na sadě modelových proteinů otestovány kolony s pouze jednou proteasou. Bylo zjištěno, že imobilizovaný AnPEP oproti ostatním proteasám nemá optimální štěpné charakteristiky. Za účelem spojení výhod výše uvedených proteas byly modelové proteiny štěpeny pomocí kolon s AnPEP koimobilizovaným s pepsinem, Nep-2 nebo XIII a také pomocí dvou proteasových kolon v sériovém zapojení (vždy AnPEP kolona s pepsinovou, Nep-2 nebo XIII kolonou v obou směrech). V rámci štěpení...
|
|
|
Eukaryotické exprese kyselých proteas.
Vodolánová, Lucie ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Nepenthesin I a neprosin jsou kyselé proteasy, které se přirozeně vyskytují v trávicích šťávách masožravých rostlin rodu Nepenthes. Oba enzymy jsou syntetizovány jako zymogeny, které jsou aktivovány v kyselém prostředí. Díky svým vlastnostem a štěpným preferencím jsou vhodné pro studium proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie či jako doplněk bezlepkové diety při celiakii. Protože v trávicích šťávách rostlin Nepenthes se vyskytují v nízké koncentraci a prokaryotický expresní systém nevykazoval uspokojivé výsledky, je snaha o nalezení vhodnějšího expresního systému pro produkci jejich rekombinantních forem, který by produkoval enzymy se stejnými vlastnostmi jako ty přírodní a zároveň poskytoval vysoké výtěžky. Cílem této práce je příprava expresních vektorů s geny nepenthesinu I a neprosinu pro transfekci do eukaryotických expresních systémů buněk S2 a HEK 293. Klíčová slova: kyselé proteasy, nepenthesin I, neprosin, expresní vektory
|
|
|
Charakterizace a využití proteas štěpících za prolinem.
Portašiková, Jasmína Mária ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Kádek, Alan (oponent)
Peptidová vazba tvořená prolinem je vůči většině známých proteas odolná, proto objev a izolace proteas štěpících za touto aminokyselinou otvírá nové možnosti nejen pro studium proteinů, ale také pro průmyslové, potravinářské či farmaceutické použití. Prolylendopeptidasa z houby Aspergillus niger (AnPEP) je enzym specificky štěpící za prolinem, který je komerčně dostupný v podobě různých produktů. Tato bakalářská práce se zabývá charakterizací a srovnáním štěpných preferencí proteas AnPEP (Clarity Ferm) a ProAlanasa (Promega). V práci je popsán vliv různých podmínek na specifitu proteas při štěpení modelových proteinů. Štěpné preference AnPEPu byly charakterizovány i na komplexních proteinových směsích a byla také připravena a testována imobilizovaná forma enzymu. Klíčová slova: ProAlanasa, AnPEP, H/D výměna, strukturní proteomika, imobilizované proteasy
|
|
| |
|
|
Proteomická a bioinformatická charakterizace N-terminálních sekvencí proteinů modifikovaných po importu do hydrogenosomu Trichomonas vaginalis.
Zákoucká, Eva ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Trichomonas vaginalis je lidským anaerobním patogenem způsobujícím trichomoniasu, jednu z nejrozšířenějších nevirových pohlavně přenosných nemocí. Toto onemocnění postihující muže i ženy je v současnosti běžně léčeno metronidazolem, avšak jsou známy případy, kdy vznikla rezistence vůči tomuto léčivu. Jelikož je Trichomas vaginalis eukaryotní organismus, je paleta cílů terapeutického zásahu proti tomuto patogenu bez ohrožení hostitele omezená. Během evoluce se Trichomas vaginalis přizpůsobila anaerobnímu prostředí vznikem alternativního anaerobního metabolismu, kdy se mitochondrie přeměnily na organely s výrazně omezenou enzmatickou výbavou. Jelikož je jedním z konečných produktů energetického metabolismu v těchto organelách molekulární vodík, nazývají se tyto organely hzdrogenosomy. Hydrogenosomy nemají vlastní genetickou informaci, všechny proteiny v nich přítomné jsou kódované v jádře, syntetizované na volných ribosomech v cytosolu a poté transportovány do hydrogenosomů pomocí N-koncových presekvencí. Peptidasa rozeznávající a odštěpující tyto presekvence, hydrogenosomální procesující peptidasa, je pro hydrogenosomy unikátní a představuje jeden z mála potencionálních terapeutických cílů pro léčbu trichomoniasy. Cílem této práce bylo určení substrátové specifity hydrogenosomální procesující...
|
|
|
Využití kyselých proteáz z láčkovek pro účely vodík/deuteriové výměny.
Darebná, Petra ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Stráňava, Martin (oponent)
Využití kyselých proteáz z láčkovek pro účely vodík/deuteriové výměny Petra Darebná (Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze, Česká republika) Láčkovky (Nepenthes), vyskytující se převážně na Borneu a Sumatře, jsou jedny z mála masožravých rostlin produkujících si své vlastní proteolytické enzymy (nepenthesin I a nepenthesin II), zajišťující rostlině náhradní zdroj dusíku a dalších živin v případě růstu na půdách tyto živiny postrádajících. Tyto aspartátové proteázy jsou schopné proteolýzy při nízkém pH, které je ustaveno v trávicí láčkové tekutině po odchytu hmyzu a ve spolupráci s dalšími proteiny se účastní digesce kořisti. Předkládaná práce se zabývá zpracováním trávicí tekutiny, izolované z láček masožravých rostlin rodu Nepenthes a jejím možným použitím jako nástroje při studiu proteinů pomocí vodík/deuteriové výměny. Izoláty trávicích tekutin byly očištěny od hrubých nečistot centrifugací, aktivovány okyselením a ultrafiltračně koncentrovány. U získaných preparátů byl sledován obsah proteinů, jejich proteinový profil a byla u nich enzymatickou esejí stanovena aktivita kyselých proteáz. Následně byly u preparátů na modelových proteinech pomocí hmotnostní spektrometrie s kapalinovou chromatografií studovány preference štěpení za podmínek vhodných pro experimenty...
|
|
|
Příprava a využití kyselých proteáz pro štěpení proteinů v experimentech H/D výměny.
Kukla, Jan ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Pompach, Petr (oponent)
- 4 - Abstrakt Vodík/deuteriová výměna ve spojení s hmotnostní spektrometrií (HX-MS) využívá spontánní výměny amidických vodíků proteinové páteře za atomy deuteria z roztoku k získání informace o změnách v proteinové struktuře. Pro lokalizaci těchto změn na konkrétní oblasti proteinu je nejčastěji využívána enzymatická digesce zkoumaných proteinů aspartátovými proteasami. Schopnost proteas produkovat malé překrývající se peptidy, které dostatečně pokrývají celou proteinovou sekvenci, je zásadní pro lokalizaci konkrétních oblastí, které nás v proteinu zajímají. V této práci byly připraveny rekombinantní proteasy nepenthesin I (z Nepenthes gracilis) a rhizopuspepsin (z Rrizopus chinensis) a byly srovnány s komerčně dostupnými proteasami prasečím pepsinem A a aspergillopepsinem (z Aspergillus saitoi). Porovnání bylo provedeno aktivitními testy, kdy byl zkoumán vliv pH, teploty a denaturačních a redukčních činidel na stabilitu a ktivitu proteas v roztoku. Všechny čtyři proteasy byly imobilizovány na polymerní nosič POROS a jejich aktivita v online HX-MS uspořádání byla testována štěpením myoglobinu jako modelového substrátu.
|
|
|
Exprese rekombinantní rozpustné formy receptoru NKR-P1A
Vaňková, Pavla ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Mrázek, Hynek (oponent)
NK buňky jsou velké granulární lymfocyty a jsou součástí přirozeného imunitního systému. Při boji proti nádorovým či virem infikovaným buňkám spouští své cytotoxické mechanismy a produkcí cytokinů dokáží zmobilizovat i pomoc ve formě adaptivní imunitní odpovědi. V poslední době jsou velkou oblastí zájmu, neboť nalezení ligandů k jejich receptorům a pochopení interakce s nimi může vést k významným objevům. Hlavně v oblasti medicíny, kde mohou mimo jiné najít uplatnění při transplantacích, v boji proti nádorovému bujení nebo HIV. Tato bakalářská práce se zabývá receptorem NKR-P1A, který je spolu s dalšími šesti receptory členem NKR-P1 rodiny. Tento protein se řadí mezi aktivační receptory a nedávno byla objevena jeho isoforma, která se od klasické formy liší tím, že postrádá větší část transmembránové domény. Cílem této práce bylo připravit produkční plasmid nesoucí gen pro mNKR-P1A ISO2 s následným testem exprese daného proteinu.
|
|
|
Studium receptor-ligandového páru NKR-P1F a Clrg
Kotýnková, Kristýna ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Studim receptor - ligandového páru NKR-P1F a Clrg Myší receptor - ligandový pár NKR-P1F a Clrg je důležitou součástí receptorového "zipu", který vzniká při kontaktu mezi NK buňkou a cílovou buňkou. Tento pár představuje jeden z příkladů nedávno objevených interakcí typu lektin-lektin, které jsou důležité při rozpoznání u mnoha imunocytů. Za účelem studia struktury těchto proteinů a jejich vzájemné interakce byly připraveny vektory pET-30a(+) pro bakteriální expresi. Tyto vektory kódovaly části extracelulárních domén obou proteinů. Po indukci IPTG byly proteiny produkovány ve formě inkluzních tělísek, ze kterých byly renaturovány in vitro. Renaturované proteiny byly purifikovány kombinací ionexové a gelové chromatografie. Konstrukt pro protein NKR-P1F poskytoval při použití standardních renaturačních protokolů pouze malé výtěžky solubilního proteinu, a navíc vyvstaly problémy s reprodukovatelností výsledků renaturace. V případě Clrg nebyly standardní postupy skládání úspěšné. Kvůli tomu bylo přistoupeno k mutaci lichého cysteinu, který nezapadal do obvyklého vzoru pro tyto receptory. Cystein byl mutován na serin a produkt výsledného C148S konstruktu již bylo možnorenaturovat in vitro. Dále bylo zjištěno, že přídavek (benzyldimethylamonnia)propansulfonátu do renaturačního pufru zvyšuje výtěžek solubilního...
|
host ::
RSS.