|
|
Adenylát cyklázový toxin bakterie Bordetella pertussis, jeho konformace a iontová rovnováha v hostitelské buňce.
Motlová, Lucia ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Adenylát-cyklázový (CyaA, ACT) toxin je jedním z hlavních virulenčních faktorů bakterie Bordetella pertussis. Ačkoli se CyaA váže na mnoho typů membrán, předpokládá se, že jeho receptorem je integrin CD11b/CD18, který je exprimován na povrchu myeloidních buněk. CyaA patří do rodiny RTX toxinů-hemolyzinů. CyaA působí na hostitelské buňky dvěma na sobě nezávislými aktivitami. Jednou z nich je přeměna ATP na cyklické AMP, kterou zajišťuje adenylát-cyklázová (AC) doména po translokaci do cytozolu hostitelské buňky, při které dochází ke vstupu vápenatých kationtů do hostitelské buňky. Translokace je pravděpodobně iniciována interakcí monomeru CyaA s cílovou membránou. Druhá aktivita CyaA je tvorba kanálu, selektivního pro kationty, který může způsobit koloidně osmotickou lyzi cílových buněk. Kanálo-tvorná aktivita je zajišťována RTX hemolyzinovou doménou a předpokládá se u ní oligomerizace, i když bylo zjištěno, že únik draselných kationtů z hostitelské buňky způsobuje CyaA ve formě monomeru. Také není jasné, zda by k oligomerizaci CyaA docházelo v roztoku, nebo až po interakci s hostitelskou membránou. Cílem této práce bylo zkoumat tok sodných iontů na membráně myších makrofágů J774A.1, které na svém povrchu exprimují CD11b/CD18 integrin. Pro dosažení tohoto cíle byly použity fluorescenční metody....
|
|
|
Supported Phospholipid Bilayers and their Interactions with Proteins Studied by Ellipsometry, Atomic Force Microscopy and Confocal Fluorescence Microscopy
Macháň, Radek ; Hof, Martin (vedoucí práce) ; Fidler, Vlastimil (oponent) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Podporované lipidové dvojvrstvy sloužily jako umělý model biologických membrán při studiu membránové aktivity 5 vybraných antimikrobiálních peptidů. Hlavními experimentálními technikami byly elipsometrie, laserová řádkovací mikroskopie a fluorescenční korelační spektroskopie. Základní principy použitých experimentálních technik jsou vysvětleny v této práci s přihlédnutím k jejich stránkám podstatným pro charakterizaci lipidových dvojvrstev. Ve stručnosti je shrnut biologický význam antimikrobiálních peptidů a jejich působení na biologické membrány a jsou představeny základní vlastnosti vybraných peptidů. Následuje rozbor hlavních typů experimentálních studií a interpretace jejich výsledků. Morfologické změny lipidových dvojvrstev byly zkoumány elipsometrií a laserovou řádkovací mikroskopií. Nejzajímavější jevy byly pozorovány v případě melittinu, který vyvolal vznik dlouhých lipidových trubic vystupujících z dvojvrstvy. Laterální difúze lipidů měřená fluorescenční korelační spektroskopií vypovídá o uspořádání dvojvrstvy na vzdálenostech pod rozlišením optické mikroskopie.
|
|
|
Structural and functional characterization of yeast plasma membrane domains
Strádalová, Vendula ; Malínský, Jan (vedoucí práce) ; Palková, Zdena (oponent) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Plazmatická membrána (PM) všech buněk hostí celou řadu důležitých buněčných funkcí. Tyto funkce musí být pečlivě koordinovány, a jak současný výzkum ukazuje, plazmatická membrána je za tímto účelem uspořádána do specializovaných domén. Naše laboratoř se zabývá výzkumem způsobu organizace plazmatické membrány u kvasinky pivní, kde bylo za použití fluorescenční mikroskopie popsáno několik nepřekrývajících se domén. Jednou takovou doménou je MCC (Membrane Compartment occupied by transporter Can1), která je tvořena stabilními izolovanými oblastmi PM o velikosti asi 300 nm. MCC domény obsahují několik přenašečů a proteinů o neznámé funkci (proteiny příbuzné Sur7 a Nce102) a jejich formování je organizováno z cytosolu proteinovými komplexy zvanými eisosomy, jež jsou tvořeny především proteiny Pil1 a Lsp1. Tato práce navazuje na studie, které měly za cíl objasnit složení, strukturu a funkci MCC. V první části práce jsme se zaměřili na ultrastrukturální analýzu MCC, přičemž jsme nejdříve vyvinuli protokol pro transmisní elektronovou mikroskopii (TEM), který dobře zachovává strukturu PM. Zjistili jsme, že mrazová fixace pomocí vysokotlakého zamražení, kombinovaná s mrazovou substitucí a zalitím vzorku do pryskyřice za nízké teploty, vede k výrazně lepšímu zachování buněčné struktury a vyššímu signálu při...
|
|
|
Charakterizace32,33-didehydroroflamykoinu - sekundárního metabolitu Streptomyces durmitorensis
Koukalová, Alena ; Černý, Jan (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Streptomycety jsou půdní Gram-pozitivní vláknité bakterie, produkující širokou škálu pigmentů a biologicky aktivních látek včetně makrolidových antibiotik. Některé z nich jsou využívány v lékařství jako antibiotika a antimykotika, jiné se uplatňují v biologickém výzkumu jako molekuly vhodné pro fluorescenční značení membrán a detekci cholesterolu. Aktinomyceta Streptomyces durmitorensis (kmen MS405T ) je bakterie izolovaná z půdních vzorků národního parku Durmitor v Černé Hoře. Produkuje sekundární metabolit 32,33-didehydroroflamykoin (DDHR), který je strukturně velmi podobný roflamykoinu a příbuzný s široce využívaným makrolidem filipinem. DDHR vykazuje cytotoxickou aktivitu vůči savčím buňkám a kvasinkám Saccharomyces cerevisiae kmene EGY48, zároveň má zajímavé fluorescenční vlastnosti. Interaguje s buněčnými membránami, díky své fluorescenci umožňuje vizualizovat některé membránové struktury (např. lysozomy), způsobuje desintegraci membrán, což vede k přestavbě aktinového a tubulinového cytoskeletu a při vyšších koncentracích k nekróze buněk. Po vazbě na cholesterol v membránách se snižuje intenzita fluorescence DDHR. Molekula se vyznačuje schopností vizualizovat aberantní lysozomy, čehož lze potenciálně úspěšně využít v diagnostice některých lysozomálně střádavých chorob.
|
|
|
Spr0334, nový protein buněčného dělení u Streptococcus pneumoniae.
Štekerová, Nela ; Doubravová, Linda (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Spr0334, nový protein buněčného dělení u Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae je významný lidský patogen. Tato bakterie kóduje ve svém genomu jediný gen pro serin/threoninovou proteinkinasu eukaryotního typu nazvanou StkP. StkP reguluje mnoho fyziologických procesů, jako např. patogenezi, kompetenci pro genetickou transformaci, rezistenci k různým druhům stresů a rezistenci k antibiotikům. Rovněž ovlivňuje transkripci celé řady genů účastnících se biosyntézy buněčné stěny, pyrimidinového metabolizmu, oprav DNA a příjmu železa. Současné studie ukázaly, že StkP je lokalizována v buněčné přepážce a významným způsobem reguluje buněčné dělení a morfologii. Mezi její substráty patří mimo jiné proteiny buněčného dělení DivIVA, FtsZ a FtsA. Porovnáním fosfoproteomových map divokého kmene a kmene ΔstkP S. pneumoniae bylo prokázáno, že StkP in vivo fosforyluje několik substrátů, mezi něž patří i membránový protein Spr0334. Hmotnostní spektrometrií byla určena místa fosforylace proteinu Spr0334, a to threonin 67 a threonin 78. Dále bylo zjištěno, že je protein Spr0334 lokalizován v buněčné přepážce, což vedlo k hypotéze, že by mohl být dalším proteinem buněčného dělení u S. pneumoniae. Hlavním záměrem této diplomové práce bylo přiblížit funkci neznámého proteinu Spr0334 u S. pneumoniae a zjistit vliv...
|
|
|
Fluorescenční studie bakteriálních membránových proteinů a buněčné signalizace.
Fišer, Radovan ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Hof, Martin (oponent) ; Forstová, Jitka (oponent)
(česky) Tato práce shrnuje pět publikací, které se zabývají převážně adenylátcyklázovým toxinem (CyaA) bakterie Bordetella pertussis a jeho interakcí s biologickou membránou. CyaA narušuje buněčné membrány tvorbou malých kationtselektivních kanálů a rozvrací buněčnou signalizaci pomocí enzymu (AC, adenylátcyklázy) přeměňujícího buněčné ATP na cAMP. První studie objasňuje mechanizmus narušování membrány v případě CyaA a příbuzného RTX toxinu, αhemolyzinu (HlyA) produkovaného Escherichia coli. K tomuto účelu byly použity lipozómy jako umělý membránový systém a fluorescenční zhášecí metoda. Oba zkoumané toxiny vykazovaly postupný únik materiálu z lipozómů a rozdílné iontové selektivity (Fišer a Konopásek 2009). Jak doprava AC domény, tak tvorba kanálů jsou závislé na vlastnostech predikovaného transmembránového αhelixu (502522). V naší práci jsme zkoumali další predikovaný transmembránový segment (565591), který nese kyselé zbytky Glu(570) a Glu(581). Většina pokusů byla prováděna na erytrocytech a planárních lipidových membránách. Zjistili jsme, že záporný náboj v pozici 570 je zásadní pro iontovou selektivitu kanálu a je patrně umístěn v blízkosti jeho ústí. Substituce v obou pozicích zásadně ovlivňují schopnost translokace AC domény...
|
|
|
Cytoplasmic membrane of Bacillus subtilis Regulation of the physical parameters
Beranová, Jana ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Branny, Pavel (oponent) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Bacillus subtilis, modelová Gram-pozitivní bakterie, uplatňuje při adaptaci své membrány k nízkým teplotám dva odlišné mechanismy: 1) Při dlouhodobé adaptaci k nižším teplotám dochází ke zvýšení poměru anteiso/iso-větvených mastných kyselin v membránových lipidech. 2) Po náhlém poklesu teploty je indukována syntéza desaturázy (Des), proteinu, který v aerobních podmínkách desaturuje řetězce mastných kyselin v lipidech cytoplazmatické membrány. Transkripce genu des, kódujícího desaturázu mastných kyselin, je indukována zvýšením uspořádanosti membrány. Pro indukci transkripce genu des je nezbytná účast dvoukomponentového systému DesK-DesR. V této práci jsem sledovala, jak kultivační podmínky ovlivňují mechanismus adaptace membrány B. subtilis k nízkým teplotám. Použity byly metody fluorescenční spektroskopie, analýza mastných kyselin, diferenciální skenovací kalorimetrie a metody molekulární biologie. V první části práce jsem se zabývala vlivem složení kultivačního media na chemické složení a biofyzikální parametry cytoplazmatické membrány B. subtilis během růstu v optimální (40 řC) a suboptimální (20 řC) teplotě. Srovnávala jsem komplexní medium s glukózou bohaté na živiny a dvě média minerální obsahující buď glukózu nebo glycerol jako zdroj uhlíku. Získaná data jasně ukazují zásadní vliv složení...
|
|
|
Fyziologické rozdíly r a K stratégů u bakterií.
Moserová, Andrea ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Krištůfek, Václav (oponent)
Fyziologické rozdíly mezi r a K-stratégy u bakterií. Současná definice bakteriálních r a K-stratégů je postavena na délce časového úseku, za který se po vysetí objeví kolonie na agarové plotně. K rozlišení r a K-stratégů v rámci dvou kmenů se někdy používá také jejich růstová rychlost. Dodnes bylo popsáno několik dalších charakteristik, které s r/K-strategiemi prokazatelně souvisí. Jendá se například o rozdílné schopnosti 1) přizpůsobit se k měnícím se podmínkám prostředí, 2) utilizace složitých nebo málo koncentrovaných substrátů, 3) využívání sekundárních metablitů jako nástrojů ekologického boje s ostatními kmeny v prostředí. Spojujícím článkem makro- a mikrobiologického r/K-konceptu je časové rozložení výskytu organismů v průběhu sukcese. Cílem této práce bylo ověřit r/K-charakteristiky u devíti vybraných bakteriálních kmenů a otestovat je na další možné rozdílnosti související s r/K-konceptem. Práce se zaměřuje na měření růstových rychlostí kmenů v tekutých i pevných médiích a na identifikaci složení membránových mastných kyselin těchto kmenů při jejich pěstování v optimální a snížené teplotě, a tedy sledování teplotní adaptace. Mimo jiné práce přináší návrh nové vlastnosti charakteristické pro K-stratégy: souvislost mezi rychlostí přirůstání průměru kolonie a vzdáleností této kolonie od nejbližší...
|
|
|
Chladová adaptace ve stacionární fázi u Bacillus subtilis
Beranová, Anna ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Svobodová, Jaroslava (oponent)
Chladová adaptace ve stacionární fázi u Bacillus subtilis Teplota je jedním z nejdůležitějších abiotických faktorů, které ovlivňují život bakteriální buňky. Nízká teplotu snižuje fluiditu cytoplazmatické membrány. Zatímco chladová adaptace u Bacillus subtilis během exponenciální fáze je relativně dobře prozkoumána, adaptace během stacionární fáze doposud systematicky prozkoumána nebyla. Stacionární fáze růstu je přitom nejobvyklejším stavem, ve kterém se mikroorganismy v přírodě vyskytují. Bakterie Bacillus subtilis uplatňují dva nezávislé mechanismy, kterými potřebnou fluiditu membráně navrací - krátkodobou a dlouhodobou adaptaci. Krátkodobá adaptace je závislá na funkci desaturázy mastných kyselin (kódované genem des), dlouhodobá adaptace spočívá ve změně poměru iso- a anteiso- větvených mastných kyselin ve fosfolipidech membrány. V této práci byla sledována adaptace membrány na stálou nízkou teplotu a na náhlé snížení teploty během stacionární fáze. Při stálé nízké kultivační teplotě, byla zaznamenána nejvyšší aktivita promotoru des při 25 řC, po náhlém snížení teploty byla zjištěna největší aktivita po přenosu z kultivační teploty 37 řC do 25 řC. Měřením anizotropie a analýzou mastných kyselin bylo zjištěno, že membrána stacionárních buněk kultivovaných při 37 řC je méně fluidní než membrána...
|
|
|
Z-scan Fluorescence Correlation Spectroscopy Applied in Studies of Model Phospholipid Membranes
Kulakowska, Anna ; Hof, Martin (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent) ; Dejneka, Alexander (oponent)
(in Czech) Tato práce je věnována lipidovým dvojvrstvám, které do značné míry určují fyzikální vlastnosti biologických membrán. Jedním z klíčových parametrů je mobilita jednotlivých složek v membráně, která je odpovědná za řadu procesů probíhajících v buňce (vazba povrchových proteinů, aktivita povrchových enzymů, agregace peptidů, buněčná adheze). Protože buněčné membrány jsou komplexní a velmi heterogenní systémy, studium jejich biofyzikálních vlastností je značně obtížné. Právě proto jsem ve své práci využívala modelové membránové systémy se zjednodušeným lipidovým složením. Cíle mé práce jsou zaměřeny na následující základní otázky, vztahující se k fosfolipidovým dvojvrstvám připraveným na pevném povrchu (ang, supported phospholipid bilayrs SPBs): Jaký vliv má pevný povrch na laterální difúzi fluorescenčně značených lipidových analogů v membráně? Jaké je propojení mezi jednotlivými vrstvami v SPBs? (publikace I) Jakým způsobem je možné určit přechod fluorescenčních sond a fluorescenčně značených lipidových analogů mezi jednotlivými vrstvami v rámci SPBs ? (publikace II) Jak je laterální difúze fluorescenčně značeného koagulačního proteinu prothrombinu, který je jen slabě vázán k SPBs, propojena s laterální difúzí fluorescenčně značených lipidových analogů v membráně? (publikace III) V této...
|
host ::
RSS.