|
|
Technologické aspekty formulování pevných roztoků
Beneš, Michal ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Bělohlav, Zdeněk (oponent) ; Dohnal, Jiří (oponent)
Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Katedra farmaceutické technologie Kandidát PharmDr. Michal Beneš Školitel Doc. RNDr. Pavel Doležal, CSc. Název disertační práce Technologické aspekty formulování pevných roztoků Pevné roztoky jsou dvou a vícesložkové, jednofázové směsi pevných látek, obvykle polymerního nosiče a účinné látky (API) v amorfním stavu. Hlavní předností těchto soustav je potenciál zvyšovat rozpustnost API, kterou obsahují. Jejich využití však komplikuje řada faktorů, které masivnějšímu rozšíření zatím brání. Mezi ně patří obtížné určování rozpustnosti léčivých látek v polymerním nosiči, malá předvídatelnost jejich fyzikální stability i těžkosti spojené s výběrem vhodného výrobního procesu a jeho fungováním v průmyslovém měřítku. Experimentální část práce je rozdělena do tří úseků. V prvním z nich byly pomocí spektrálních zobrazovacích metod (infračervená a Ramanova mikrospektrometrie) hodnoceny polymerní filmy s obsahem API (dabigatran etexilát) nanesené na skleněných deskách. Hodnocené vzorky obsahovaly jeko polymerní nosič Kollidon VA64, Povidone K30 a Soluplus, každý s obsahem 10, 25, 50 a 75 % (m/m) API. U vzorků s obsahem Kollidonu VA64 a Soluplusu s obsahem 75 % API bylo detekováno vydělování částic API, tedy druhá fáze. V další části práce byl...
|
|
|
Zavedení APEXového značení pro výzkum mitochondriálních organel Giardia intestinalis a Trichomonas vaginalis.
Drašnarová, Zuzana ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Rothová, Olga (oponent)
Giardia intestinalis a Trichomonas vaginalis jsou parazitičtí prvoci žijící v anaerobním prostředí. Z tohoto důvodu došlo k přeměně mitochondrií na organely, ve kterých neprobíhá oxidativní fosforylace. O mezimembránovém prostoru (IMS) mitochondriálních organel těchto organismů však není mnoho známo. Hlavním důvodem je obtížná izolace proteinů IMS pomocí klasických metod molekulární biologie, jako je buněčná frakcionace. Nedávno došlo k vytvoření nového značení pomocí askorbát peroxidázy (APEX). Toto značení je možní použít pro fluorescenční i elektronovou mikroskopii. APEX se také může chovat v přítomnosti biotin-fenolu jako biotin ligáza, umožňuje tak značení proteinů daného kompartmentu a také jejich izolaci. Optimalizovali jsme podmínky pro optimální aktivitu APEXu a pomocí této techniky se nám podařilo vizualizovat IMS hydrogenosomů T. vaginalis a izolovat hydrogenosomální proteiny.
|
|
|
Struktura a funkce mitochondriálního sekretinu.
Klápšťová, Veronika ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Pyrih, Jan (oponent)
Sekreční systém typu II (T2SS) je jedním ze sekrečních systémů, pomocí nichž gramnegativní bakterie transportují některé ze svých proteinů přes vnější membránu. Vlastní přechod přes membránu je zprostředkován pórem tvořeným několika kopiemi proteinu zvaného GspD neboli sekretin. Ten byl objeven spolu se třemi dalšími podjednotkami T2SS v genomu některých prvoků, například u Naegleria gruberi, Andalucia godoyi, Reclinomonas americana, Neovahlkampfia damariscottae či u dvou zástupců rodu Malawimonas. Bylo zjištěno, že tyto proteiny lokalizují do mitochondrie. Pokud by byla zachována původní funkce i orientace T2SS, jednalo by se o naprosto unikátní systém, neboť export proteinů z mitochondrií doposud nebyl popsán. Sekretin je zcela esenciální podjednotkou T2SS, která neplní pouze roli pasivního membránového kanálu, ale účastní se aktivně i rozpoznávání substrátu. Studium eukaryotického sekretinu by tedy mohlo přinést cenné poznatky o funkci mitochondriálního T2SS. Experimentální část této diplomové práce se proto zaměřuje na charakterizaci eukaryotického GspD, zabývá se skládáním sekretinového kanálu v bakteriích a umělých membránách, popisem jeho interakcí s dalšími podjednotkami a mechanismem importu sekretinového monomeru do mitochondrií.
|
|
|
Nanovlákenné membrány jako nosiče léčiv
Vrbata, Petr ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Vetchý, David (oponent) ; Podzimek, Štěpán (oponent)
Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra: Farmaceutické technologie Kandidát: Mgr. Petr Vrbata Školitel: Doc. RNDr. Pavel Doležal, CSc. Název disertační práce: Nanovlákenné membrány jako nosiče léčiv Nanovlákenné membrány patří v současnosti mezi intenzivně studované a aplikačně velmi rychle se rozvíjející typy materiálů. Jejich vlákna jsou charakterizovány dvěma dimenzemi v řádu desítek až stovek nanometrů. Díky obrovskému měrnému povrchu a dalším výhodným vlastnostem našly využití v řadě technických odvětví a jejich využití v oblasti medicíny a farmacie jako nosičů léčiv, krytí ran či podkladů pro kultivaci buněk je v současnosti velmi aktuálním tématem. V disertační práci jsou zkoumány nově formulované nanovlákenné membrány s obsahem léčiv vytvořené velkoprodukční technologií elektrospiningu z několika vybraných polymerů různorodých vlastností. Cílem bylo experimentálně prozkoumat a případně doložit možný přínos využití nanovlákenných nosičů léčiv pro vybrané aplikační cesty a lékové formy. Membrány byly charakterizovány skenovací elektronovou mikroskopií a diferenční skenovací kalorimetrií, jež prokázaly úspěšnou inkorporaci léčiv do struktury pravidelných polymerních nanovláken a potvrdily hypotézu o fixaci léčiva ve struktuře nanovláken v podobě...
|
|
|
Nanodisperzní aplikační soustavy.
Pekárková, Veronika ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Musilová, Marie (oponent)
Práce shrnuje základní informace o biofarmaceutickém farmaceutickém systému a disperzních soustavách a pevných roztocích v oblasti aplikačních sou- stav léčiv. Experiment je nejprve zaměřen na in vitro hodnocení disoluce nanovlá-kenných membrán vyrobených elektrospiningem. Membrány obsahovaly v sušině 10 % směsi hovězího albuminu a FICT albuminu v poměru 1:1 a dále polythylenoxid a polyvinylalkohol v sušině. Hlavním úkolem práce bylo ověření transmukosální permeace albuminu sublingvální membránou prasete in vitro. Akceptorovou fází byl fosfátový pufr o pH 7,4. V rozpouštěcím pokusu bylo potvrzeno velmi rychlé rozpouštění nosičo-vé nanovlákenné membrány s obsahem albuminu. Většina albuminu byla dostup-ná k analýze již do 3, resp. 5 minut. Časový průběh in vitro permeace albuminu přes sublingvální membránu ukázal až 24 h trvající lineární periodu, a to jak při permeaci z nanovlákenných membrán tak i ze srovnávacího roztoku. Průměrné hodnoty fluxů albuminu za daných podmínek činily cca J = 0,81 [ng/cm2/h] v případě 64vrstevné nanomembrány z donorového prostředí pH 6,8, dále J = 0,40 [ng/cm2/h] při SEM = 0,4 a z nanomembrány v donorovém prostředí pH 7,4 a také J = 0,77 [ng/cm2/h] při pH 6.8.
|
|
|
Vliv přídavku viskozifiantů na vlastnosti nanoemulzí II.
Dostálová, Alžběta Dorota ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Musilová, Marie (oponent)
V nanoemulzích, které jsou mléčně zakalené, se rozměry vnitřní diskontinuální fáze pohybují nejčastěji v rozmezí hodnot mezi 200 nm a 300 nm. Na rozdíl od mikroemulzí, které jsou transparentní a termodynamicky stabilní, podléhají nanoemulze řadě stejných destabilizačních procesů jako makroemulze, včetně Ostwaldova zrání. Přidání viskozifiantu ovlivňuje stabilitu systému, přičemž obecně platí, že zvýšením viskozity vnější spojité fáze se celý emulzní systém fyzikálně stabilizuje. Je-li zvýšení viskozity nanoemulze dáno přítomností polymerního viskozifiantu, může při překročení určité koncentrace polymerního viskozifiantu dojít naopak k destabilizaci. Tohoto efektu bylo v práci využito k rozhodnutí o výběru vhodné olejové fáze nanoemulzí. Jako viskozifianty byly zvoleny dva deriváty celulózy, konkrétně hypromelóza (HPMC) a hydroxyethylcelulóza (HEC), které byly k předem připraveným nanoemulzím přidány v koncentracích 0,083; 0,167; 0,333 a 0,667 ‰. Vzniklé soustavy byly po zpracování proměřeny metodou DLS, ke zjištění velikosti dispergovaných částic olejové fáze a viskozitně, metodou kapilární viskozimetrie. Jako metoda zrychlených stabilitních testů byla zvolena zkouška tepelným namáháním. Vzorky byly vystaveny 5 cyklům změn teploty z 8 řC na 40 řC. Velikost částic byla v průběhu teplotního namáhání...
|
|
|
Sekreční systém typu II v mitochondriích Naegleria gruberi.
Krupičková, Alžběta ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Hampl, Vladimír (oponent)
V membránách gramnegativních bakterií se nachází několik typů transportních (sekrečních) systémů, které exportují proteiny do vnějšího prostředí bakterie. Mezi takové sekreční systémy patří i sekreční systém typu II (T2SS), který transportuje sbalené proteiny přes vnější membránu. Klíčové podjednotky T2SS byly objeveny v genomech některých prvoků patřících do skupiny Discoba a Malawimonada, včetně druhů Naegleria gruberi a Malawimonas sp. str. 249. Naše experimenty ukazují, že jsou tyto podjednotky lokalizovány v mitochondrii těchto prvoků. Objev těchto genů u eukaryot je překvapivý, a pokud by v mitochondriích těchto protist fungoval T2SS jako exportní sekreční systém, jednalo by se o mitochondrii na evolučním mezistupni, která je schopna jak proteiny importovat tak exportovat. V experimentální části této práce jsme studovali, jestli a jak spolu proteiny N. gruberi a M. sp. str. 249 interagují. Prokázali jsme četné interakce mezi proteiny, které odpovídají bakteriálnímu uspořádání T2SS. K tomu jsme využili metod kvasinkového dvouhybridního systému a bakteriálního dvouhybridního systému. Dále jsme zkoumali import klíčové podjednotky T2SS, pseudopilinu, N. gruberi do vnitřní membrány mitochondrií a import sekretinu M. sp. str. 249 do vnější membrány mitochondrií.
|
|
|
Nanovlákenné membrány jako nosiče léčiv 12
Fojtíková, Veronika ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Dittrich, Milan (oponent)
Hlavní výhody systémového sublingválního podání léčiv lze spojovat s bohatým krevním zásobením a velmi malou tloušťkou dané biologické membrány neobsahující buňky zrohovatělého slizničního epitelu. Teoretická část práce dílčím způsobem koriguje skutečnost, že dosud málo pojednanou problematikou sublingvální aplikační cesty je její souvislost s vlivem slin a mukosálních povlaků. Stěžejním úkolem experimentu bylo ověření možnosti využití albuminu (BSA) jako součásti potenciálního nosiče léčiv v nanovlákenných membránách pro sublingvální aplikaci. Sublingvální membrány byly získány preparací z jazyka prasete domácího (Sus scrofa) s následným rychlým zmrazením v kapalném dusíku a dalším uchováváním při - 20 řC. V in vitro pokusech zahrnujících i využití slin jako média zprostředkujícího kontakt léčiv s epitely sublingvální sliznice byl hodnocen průnik fluorescenčně značeného hovězího sérového albuminu (FITC-BSA o molekulové hmotnosti asi 68 000). Jeho aplikace v podobě 32vrstevných a 16vrstevných nanovlákenných nosičů s obsahem na úrovni 30 procent hmotnostních a srovnání s permeací z koncentračně ekvivalentního roztoku lyofilizovaného BSA přineslo tato zjištění: 1. FITC-BSA sublingvální membránou pronikal vždy, a to na úrovni fluxů J v řádu jednotek µg/cm2 .h-1 2. Nebyla zaznamenána snížená permeace...
|
|
|
Nanovlákenné membrány jako nosiče léčiv
Vrbata, Petr ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Vetchý, David (oponent) ; Podzimek, Štěpán (oponent)
Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra: Farmaceutické technologie Kandidát: Mgr. Petr Vrbata Školitel: Doc. RNDr. Pavel Doležal, CSc. Název disertační práce: Nanovlákenné membrány jako nosiče léčiv Nanovlákenné membrány patří v současnosti mezi intenzivně studované a aplikačně velmi rychle se rozvíjející typy materiálů. Jejich vlákna jsou charakterizovány dvěma dimenzemi v řádu desítek až stovek nanometrů. Díky obrovskému měrnému povrchu a dalším výhodným vlastnostem našly využití v řadě technických odvětví a jejich využití v oblasti medicíny a farmacie jako nosičů léčiv, krytí ran či podkladů pro kultivaci buněk je v současnosti velmi aktuálním tématem. V disertační práci jsou zkoumány nově formulované nanovlákenné membrány s obsahem léčiv vytvořené velkoprodukční technologií elektrospiningu z několika vybraných polymerů různorodých vlastností. Cílem bylo experimentálně prozkoumat a případně doložit možný přínos využití nanovlákenných nosičů léčiv pro vybrané aplikační cesty a lékové formy. Membrány byly charakterizovány skenovací elektronovou mikroskopií a diferenční skenovací kalorimetrií, jež prokázaly úspěšnou inkorporaci léčiv do struktury pravidelných polymerních nanovláken a potvrdily hypotézu o fixaci léčiva ve struktuře nanovláken v podobě...
|
|
|
Export biomolekul z mitochondrií.
Pelc, Josef ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Kovalčíková, Jana (oponent)
Mitochondrie je buněčná organela, která vznikla z endosymbiotické bakterie. Díky svému původu si zachovala některé unikátní vlastnosti a metabolické dráhy. Mitochondrie nebo její redukované formy jsou přítomny s jedinou známou výjimkou ve všech eukaryotických organismech. Převážná část mitochondriální DNA byla přesunuta do jádra. Přesto však je mitochondrie schopná kódovat několik proteinů, které jsou součástí elektron-transportního řetězce a ATP syntázy. Tyto proteiny jsou z matrix mitochondrie transportovány do vnitřní mitochondriální membrány. Špatně složené proteiny vnitřní mitochondriální membrány jsou degradovány mitochondriálními proteázami a dochází k uvolňování peptidů. Matrix mitochondrie je místem vzniku Fe-S klastrů. Dosud neznámá molekula, která je produktem této dráhy, se dostává do cytosolu a účastní se skládání cytosolických a jaderných Fe-S proteinů. Další transportní dráha zajišťuje výměnu lipidů mezi endoplazmatickým retikulem a mitochondrií. Obě mitochondriální membrány mají různé lipidové složení. Pro udržení jejich vlastností je vyžadován transport lipidů mezi oběma mitochondriálními membránami. Tato dráha je využívána i pro syntézu specifických lipidů na vnitřní mitochondriální membráně.
|
host ::
RSS.