|
|
Function and localization of the SUN family of proteins in yeast populations
Kuznetsov, Evgeny ; Palková, Zdena (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent) ; Malcová, Ivana (oponent)
Rodina SUN proteinů (Uth1p, Sun4p, Sim1p, Nca3p) je skupina proteinů vyskytujicích v houbach a podobných glucanazům bunečny steny. SUN proteiny mají vysokou homologie v jejich C-terminalní doméně která je 256 aminokyselin dlouhá. Naše předchozí studium vývoje kvasinkových koloní odhalilo, že členy rodiny SUN proteinů mohou byt zapojený do procesu stárnutí a také mohou hrát důležitou roli pro přežívaní během vývoje a růstu mnohobunečné kvasinkové populace. V naší laboratoři jsme provedli microarray analýzu změn expresí genů v koloních, ktera ukázala výrazné změny v urovni exprese člena SUN rodiny UTH1. Kmen s deletovaným UTH1 genem vykazuje zpomalenější růst a horší přeživaní v kvasinkových koloních při porovnaní s wild type kmenem. Nicméně v své práci jsem se soustředil na identifikaci a ziskaní vice informací o funkcích jednotlivych SUN proteinů a zjištění jejich přesné lokalizace. Je zajimavé, že nekteré SUN proteiny mají duální lokalizaci (Uth1p a Sun4p) v mitochondrích a buněčné stěně a mohou byt spojeny s jejich funkcí. V této disertační práci, kapitola "Results and discussion" byla rozdělena na dvě části: první adresovaná otázkám, které se týkají lokalizace, regulaci zavislé na kysliku a možne zapojení SUN proteinů v remodelaci buněčné stěny. Druhé časti předcházel vývoj nové metody...
|
|
|
Analýza mutantů Rpg1/eIF3a v Saccharomyces cerevisiae.
Luxová, Pavla ; Malcová, Ivana (vedoucí práce) ; Binarová, Pavla (oponent)
Rpg1/Tif32/eIF3a je esenciální a největší podjednotkou translačního iniciačního faktoru eIF3 kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Vedle jejích interakcí v rámci eIF3 komplexu byla již dříve popsána též její vlastnost interagovat s mikrotubuly. Předběžné výsledky laboratoře s kmeny v genetickém pozadí W303 ukázaly na existenci syntetického fenotypu rpg1-2 mutanty s mikrotubulárním inhibitorem nokodazolem. Cílem této práce byla analýza "mikrotubulárního fenotypu" rpg1-2 mutanty a objasnění možného vlivu odlišného genetického pozadí. Prokázala jsem, že nezávisle na genetickém pozadí kmene (W303, BY, SEY) byly všechny analyzované mutanty rpg1-1, rpg1-2 a rpg1-3 termosenzitivní. Zjistila jsem však, že tyto mutanty v BY a SEY genetickém pozadí za nepermisivních podmínek (37řC, 4 h) nevykazují terminální fenotyp a nezastaví buněčný cyklus v G1 fázi, tak jak bylo popsáno dříve u kmenů pozadí W303. Tyto mutantní kmeny také nevykazovaly zvýšenou citlivost k benomylu a žádná z testovaných mutací v těchto kmenech neovlivňuje obnovu mikrotubulárního systému po uvolnění z působení nokodazolu. Připravila jsem nové kmeny s kombinací delece genu BUB1 s jednotlivými testovanými termosenzitivními mutacemi v genu RPG1. Podrobná fenotypová analýza těchto dvojitých mutantů ukázala, že disfunkce obou genových produktů vede...
|
|
|
Vliv sekvencí intronů na efektivitu sestřihu v Saccharomyces cerevisiae.
Oplová, Michaela ; Půta, František (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent)
Sestřih pre-mRNA je vysoce regulovaným buněčným procesem. Regulace tohoto procesu vyplývá ze současné souhry spliceosomu a dalších sestřihových faktorů, které dokážou interpretovat cis-elementy molekuly pre-mRNA. Krátké konzervované sestřihové sekvence intronu představují základní a nezbytné elementy pro vystřižení intronových sekvencí z primárního transkriptu, přesto ale nejsou dostatečnými prvky intronu pro efektivní proces sestřihu. Další vlastnosti molekuly pre-mRNA zasahují do složité regulace sestřihu. Ve své práci se zabývám vlivem sekvencí intronů z genů ACT1 a MAF1 na efektivitu sestřihu v buňkách s narušeným spliceosomem (prp45(1-169)). Výsledky ukazují regulační úlohu oblasti intronu genu ACT1 mezi místem větvení (BP) a 3' sestřihovým místem (3'ss), která udržuje efektivní sestřih v mutantních buňkách. Konkrétní element intronu genu ACT1 v oblasti BP-3'ss však nebyl identifikován. Ve své práci dále ukazuji, že alternativní BP sekvence nacházející se v intronu genu ACT1, která je lokalizována mimo oblast BP-3'ss, je dalším elementem, který moduluje efektivitu sestřihu u kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Práce se dále věnuje sestřihovým faktorům, které by mohly figurovat v mechanismu výběru 3'ss. Na umisťování 3'ss do aktivního centra spliceosomu se významně uplatňuje heterodimer proteinů...
|
|
|
Role of formins in the organization and dynamics of intracellular structures in Arabidopsis thaliana
Rosero Alpala, Elvia Amparo ; Cvrčková, Fatima (vedoucí práce) ; Baluška, František (oponent) ; Malcová, Ivana (oponent)
Na základě podrobné fenotypové charakterizace fh1 a fh2 mutantů bylo prokázáno, že AtFH1 (At3g25500), nejvíce exprimovaný formin Arabidopsis thaliana, a jeho nejbližší homolog AtFH2 (At2g43800) ovlivňuje dynamiku aktinových mikrofilament a mikrotubulů. Mutanti postrádající fh1 vykazovali zvýšenou citlivost k inhibitoru polymerace aktinu Latrunculinu B (LatB). Epidermální buňky děložních lístků forminových mutantů byly výrazněji laločnaté než u divokého typu, a byly také nalezeny rozdíly v uspořádání vodivých pletiv. Nepodařilo se získat dvojité homozygoty fh1 fh2, protože nejméně jeden z těchto dvou forminů je zřejmě nezbytný pro řádný vývoj gametofytu. Byly standardizovány metody pro pozorování a kvantitativní charakterizaci architektury a dynamiky kortikálního cytoskeletu s využitím konfokální laserové skenovací mikroskopie (confocal laser scanning microscopy, CLSM) a epifluorescenční mikroskopie s variabilním úhlem osvitu (variable angle epifluorescence microscopy, VAEM). Pomocí těchto metod se podařilo zjistot, že mutanti mají více F-aktinových provazců, které jsou méně dynamické než v rostlinách divokého typu, avšak dynamika mikrotubulů je zvýšená. Kořenový fenotyp, fh1 mutantů byl nadále zesílen v přítomnosti heterozygotní fh2 mutace. SMIFH2, inhibitor aktivity forminů, vyvolával podobné...
|
|
|
Molekulární podstata interakce rostlinného HSP90 s mikrotubuly
Benáková, Martina ; Krtková, Jana (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent)
Mikrotubuly (MT) jsou jednou ze základních buněčných struktur a účastní se mnoha klíčových dějů v rostlinných buňkách a jejich vlastnosti a funkce jsou ovlivňovány a modifikovány dalšími proteiny. Tyto proteiny řadíme do skupiny proteinů asociovaných s mikrotubuly (MAPs, microtubule-associated proteins). Jedním z MAP je také mnou zkoumaný molekulární chaperon Hsp90, který zastává v buňce velké množství nejrůznějších funkcí. Mimo jiné u něj byla již v minulosti prokázána kolokalizace s MT (Freudenreich a Nick, 1998; Petrášek et al., 1998). Přímá vazba k MT byla však popsána teprve nedávno, a to za pomoci kosedimentačních reakcí specifické tabákové cytozolické izoformy Hsp90, která byla díky své schopnosti vázat MT nazvána Hsp90_MT. Zároveň bylo zjištěno, že vazba k MT je nezávislá na aktivitě ATP (Krtková et al., 2012). Ve zmíněné práci autoři také zjistili pozitivní vliv Hsp90_MT na obnovu MT vystavených chladovému stresu. Přestože se na dynamice MT cytoskeletu podílí v obrovské míře právě MAP, je s podivem, že u mnohých z nich dosud není známá molekulární podstata interakce s MT, tedy jejich MT-vazebná doména. Rozhodli jsme se proto určit tuto doménu u tabákového Hsp90_MT za pomoci tvorby rekombinantních proteinů obsahujících charakteristické domény pro rodinu Hsp90 a následných kosedimentačních...
|
|
|
Ustavení a změny polarity v průběhu buněčného cyklu Saccharomyces cerevisiae
Luxová, Pavla ; Malcová, Ivana (vedoucí práce) ; Šťovíček, Vratislav (oponent)
Buněčnou polaritu lze definovat jako asymetrickou organizaci a distribuci biomolekul, buněčných organel a struktur, která je důležitá pro řadu buněčných procesů a její vytvoření je esenciální pro zdravý vývoj všech organismů. Tato práce se zaměřuje na hlavní mechanismy založení buněčné polarity, jejího udržení a změn v průběhu buněčného cyklu u kvasinky Saccharomyces cerevisiae, která je jedním z preferovaných modelových organismů. Pro přesnou determinaci místa, kde následně vznikne nová buňka, jsou určujícím prvkem prostorové značky nahromaděné v místě předchozího dělení. K jejich rozpoznání jsou zapotřebí Rho GTPázy, které působí na své efektory a tím ovlivňují aktinový cytoskelet a septiny. Tyto struktury jsou nezbytné pro polarizovaný růst pupene. Růst a vývoj pupene je provázaný a regulovaný spolu s buněčným cyklem, na jehož konci se pupen oddělí, čímž vznikne nová buňka. Proces zrodu nové, mladé buňky, která je schopná projít mnohem větším počtem dělení než zbývají její matce, je novou výzvou ke studiu polarity z hlediska stárnutí buněk.
|
|
|
Postranslational modifications in DNA damage response
Moudrý, Pavel ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent) ; Mistrík, Martin (oponent)
Náš genetický materiál je neustále vystavován působení mnoha faktorů a procesů, které představují enormní hrozbu pro naši schopnost přenášet genetickou informaci potomkům i pro naše vlastní přežití. Buňky mají mnoho mechanismů schopných detekovat a opravovat poškozenou DNA, souborně označovaných jako buněčná odpověď na poškození DNA (DDR). Aby došlo k optimalizaci oprav poškozené DNA a k potlačení jejích změn během normálních buněčných procesů, musí být DDR striktně regulována v čase i prostoru. Defekty v opravě DNA vedou ke genomové nestabilitě a v konečném důsledku až k rozvoji nádorových a neurodegenerativních onemocnění. Tato práce je kompilací výsledků čtyř projektů zaměřených na molekulární mechanismy buněčné odpovědi na poškození DNA a vytváření multiproteinových signalizačních a opravných komplexů v místech poškození DNA. Identifikovali jsme protein NUP153, který je součástí jaderného póru, jako nový faktor nezbytný pro jaderný import proteinu 53BP1 a buněčnou odpověd na poškození DNA. Ukázali jsme, že potlačení exprese NUP153 brání akumulaci proteinu 53BP1 v jádře nově utvářených dceřinných buňek, což vede k omezení akumulace proteinu 53BP1 v místech poškozené DNA indukovaných ionizujícím zářením, ke zpomalení oprav poškozené DNA, ke zvýšení citlivosti buněk k ionizujícímu záření a ke zhoršení...
|
|
|
Interakce proteinů Prp22 a Prp45 ve spliceosomu pučící kvasinky
Senohrábková, Lenka ; Půta, František (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent)
Protein Prp22 je DEAH box RNA helikáza, která má dvě funkce v sestřihu pre-mRNA: účastní se druhé transesterifikační reakce (ATP independentní funkce) a uvolňuje maturovanou mRNA ze spliceosomu (ATP dependentní funkce). Prp45p, kvasinkový ortholog lidského transkripčního koregulátoru SNW/SKIP, je esenciální sestřihový faktor, přítomný ve spliceosomu po celou dobu sestřihové reakce. Mutanta prp45(1-169) geneticky interaguje s některými alelami NTC komplexu a sestřihovými faktory druhého kroku, včetně PRP22. Jedním z výsledků této práce je zjištění, že mutanty prp22(-158T) a prp22(-327A), které jsou synteticky letální s mutací prp45(1-169), mají kvůli mutaci v upstream regulační oblasti sníženou hladinu proteinu Prp22. Mutanty prp22(-158T), prp22(300PPI) a prp22(-327A) ovlivňují sestřih pre-mRNA s mutací v 5'ss v závislosti na sekvenci druhého exonu. N-terminální mutanty prp22(∆301) a prp22(∆350) jsou synteticky letální s prp45(1-169). Syntetická letalita je možná způsobena snížením efektivity vazby Prp22p do spliceosomů na úroveň, která není pro buňky již viabilní.
|
|
|
Plasma-membrane alkali-metal-cation transporters involved in salt tolerance of pathogenic Candida species
Krauke, Yannick ; Sychrová, Hana (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
of Ph.D. Thesis Conclusions All the aims of the thesis were achieved. The tolerance to alkali metal cations of four pathogenic Candida species was studied in detail and revealed differences among the yeasts. These differences in sall tolerance remained the same under various growth conditions. For the first time, the internal sodium and potassium concentrations of several Candida species were estimated under high salt-stress grolvth. The internal K./Na* ratio was not in relation with the salt tolerance revealing different adaptation mechanisms to salt stress in Candida species. A first study on combinatory use of fluconazole and NaCl revealed severe synergistic effects of both compounds, leading to grovvth inhibition and increased internal Na* concentrationsi n C. albicans.T he molecularb asis of this synergismr emains to be established. Ihe C. dubliniensis, C. glabrata and C. parapsilosis Cnhl NalH- antiporters were cloned and functionally characterized upon heterologous expression in S. cerevlslae to understand the mechanisms involved in the different salttolerances of Candida species. The three antiporters differed in their activity for alkali metal cations, which roughly correlated with the observed differences in salt tolerance among the species. Additionally, during the characterization of...
|
host ::
RSS.