|
|
Analysis of C. necator genome changes after evolutionary adaptation
Vojsovič, Matúš ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The p53 protein is a transcription factor that belongs to the group of the tumour suppressor proteins. p53 functions include cell cycle regulation, interaction with DNA, and responses to damaged DNA that may lead to apoptosis or even senescence may occur. The theoretical part summarizes the latest information about the chemical structure and functions of the protein p53 and allosteric modifications that the p53 protein may possess in cells. It also describes selected methods of isolation and characterizes proteins. The aim of the experimental part was to isolate and characterize -isoforms of the p53 protein, which were isolated from the microorganism E.coli. Protein production was preceded by preparation and transformation of plasmids into production cells. From the production cells, 4 -isoforms of p53 were isolated by affinity chromatography, due to the polyhistidine anchor that the proteins contain. The isolated proteins were subsequently characterized by SDS-PAGE and western blotting. Moreover, the transactivation potential in the yeast system was monitored by luciferase assay under conditions involving the use of various culture media, as well as expressed or coexpressed under the inducible GAL1 promoter and the constitutive GPD promoter.
|
|
|
Molekulárně biologická charakterizace vybraných producentů PHA
Kubáčková, Eliška ; Brázda, Václav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá molekulárně biologickou charakterizací vybraných producentů polyhydroxyalkanoátů (PHA). V rámci práce byly pomocí molekulárně biologických metod identifikovány a charakterizovány PHA produkující termofilní izoláty pocházející ze vzorků aktivovaného kalu a kompostu. Sekvenací 16S rRNA genu byly termofilní izoláty identifikovány a taxonomicky zařazeny do kmene bakterií Firmicutes. U těchto bakteriálních izolátů byla stanovena schopnost produkce PHA na úrovni genotypu pomocí konvenční PCR detekcí phaC genu kódujícího PHA syntázu, který je klíčovým enzymem biosyntézy PHA. U většiny izolovaných bakterií byly detekovány PHA syntázy I., II. a IV. třídy, přičemž PHA syntázy tříd I a II nejsou pro detekované rody bakterií charakteristické. Největšího zastoupení izolátů představoval druh termofilní bakterie Aneurinibacillus thermoaerophilus, u kterého byla detekována PHA syntáza IV. třídy. V druhé části diplomové práce byla zavedena metoda RT-qPCR pro studium exprese vybraných genů bakterie Cupriavidus necator H16 zapojených do metabolismu PHA. V rámci zavedení metody byla provedena optimalizace PCR detekce vybraných genů a optimalizována kvantifikace genů pomocí real-time PCR. Testovaná metoda zahrnovala kroky izolace RNA, syntézu cDNA a kvantifikaci úseků genů, u nichž byly na základě získaných dat stanoveny kritické body metody.
|
|
|
Optimization of p53 mutant protein isolation and its DNA binding properties
Osadchuk, Olha ; Zemanová, Jana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
P53 protein is one of the most important molecules in the human body. It is responsible for several cellular processes such as DNA repair, cell cycle or induction of apoptosis. P53 is also known as “guardian of the genome”. DNA binding ability of p53 is important for the normal cell development and growth. Different mutation of TP53 gene, may cause lost of p53 binding ability andits tumor suppressor function that may lead to the cancer development. The theoretical part of this diploma thesis, is focused on the characterization of main properties, function and mechanism of p53 protein activation and description oflocal secondary DNA structures. The main goal of the experimental part was production of four mutant forms of p53 protein and wild-type p53 protein and studying its binding properties with different local secondary DNA structures. Using Gateway cloning system, four expression vectors were prepared and used for protein production in the bacterial expression system. In total, four mutant and one wild-type p53 protein were prepared and their DNA binding properties were evaluated by Electrophoretic Mobility-Shift Assay The results suggest different DNA-binding properties of wild-type p53 and mutant forms of this protein. All studied mutant proteins lost ability to bind DNA sequence specifically, whereas non- specific interaction with DNA were sustained for three out of four mutant forms. One of the studied mutant proteins showed preference for superhelical form of DNA.
|
|
|
Izolace a analýza DNA se zaměřením na mikroorganismy důležité v potravinářství
Čutová, Michaela ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Fojtová,, Miloslava (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Identifikace bakteriální DNA se skládá z několika kroků: lyze buněk, izolace a purifikace DNA, precipitace ethanolem a identifikace bakteriálního kmene pomocí PCR, případně i jiných molekulárně biologických metod. Každý krok musí být optimalizován. Nukleové kyseliny lze z buněk s výhodou izolovat pomocí magnetických nosičů. Molekuly DNA jsou na povrch magnetického nosiče navázány na základě elektrostatických interakcí a posléze jsou eluovány do pufru. Cílem práce bude optimalizace jednotlivých kroků identifikace bakteriální DNA: buněčná lyze, izolace DNA, charakterizace pevných magnetických nosičů funkcionalizovaných aminoskupinami pro izolaci nukleových kyselin. Přítomnost DNA v eluátu bude ověřena pomocí gelové agarosové elektroforézy a množství eluované DNA bude stanoveno spektrofotometricky. Kvalita izolované DNA bude bude ověřena její amplifikací s použitím polymerázové řetězové reakce (PCR). Dále je práce zaměřena na studium sekundárních struktur nukleových kyselin – křížových struktur a kvadruplexů. Tyto struktury se podílí na regulaci buněčných procesů a jejich výskyt je spojován s vývojem onkologických a neurodegenerativních onemocnění. Byla provedena analýza genomu in silico u mikroorganizmů významných v potravinářském průmyslu. Sevence genomů mikroorganismů byly získány z databáze NCBI (National Center for Biotechnology). Pro analýzu byl použit software Palindrome Analyser a G4 Hunter.
|
|
|
Comparison of biotechnological procedures for pure proteins preparation
Bušanski, Patrik ; Langová, Denisa (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The production of recombinant proteins is a biotechnological process during which proteins are produced in foreign organisms by gen manipulation. To form a recombinant plasmid the gene encoding the desired protein is isolated and inserted into an expression vector. The plasmid is then transformed using physical or chemical method into a suitable host, where the recombinant gene is translated into amino acid sequence in the newly synthetized protein. The theoretical part of this bachelor thesis includes characteristics of proteins, methods of recombinant protein preparation and compares individual expression systems. Three isoforms of the p53 protein, which were synthesized in the E. coli microorganism, were selected for processing the experimental part. The transformed recombinant plasmid contained two tags for purification, HIS-tag and GST-tag, making it possible to compare the efficacy of the two purification methods. HIS-tag purification was found to work for all three isoforms better, with concentrations of recombinant proteins were several times higher than those of the GST-tag. The p53 proteins are about 50 kDa long, what was confirmed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis.
|
|
|
Optimalizace izolace plazmidové DNA pomocí magnetických částic
Chlopková, Barbora ; Zemanová, Jana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Teoretická část práce shrnuje poznatky ohledně izolace a přečištění plasmidové DNA a nukleových kyselin jako takových. Plasmidová DNA se používá často v genovém inženýrství jako vektor pro přenos určitého genu do buňky. Její izolace a přečištění v dostatečné kvalitě je klíčovou pro další procesy s tímto spjaté. V experimentální části byla zkoumána izolace a přečištění pDNA pomocí magnetických nosičů v přítomnosti různých koncentrací PEG 8000 v kombinaci s 1M NaCl. Dále byla zkoumána izolace pDNA pomocí komerčních kitů.
|
|
|
Testování působení chemických látek na viabilitu buněčných linií
Zemanová, Anita ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce pojednává o vlivu vybraných chemických látek na viabilitu buněčných linií. V teoretické části práce jsou rozebrány poznatky o možnostech léčby rakoviny pomocí chemoterapeutik včetně jejich mechanismu působení a nežádoucích účinků. Dále jsou zde popsány alternativní struktury DNA se zaměřením na G-kvadruplexy a ligandy, které s G-kvadruplexy interagují. Tyto látky jsou považovány za slibná léčiva při boji proti rakovině díky jejich vysoké specifitě vůči G-kvadruplexům nacházejících se v telomerách chromozomů. Ligandy interagující s G-kvadruplexy stabilizací G-kvadruplexů mohou inhibovat enzym telomerasu nezbytnou pro prodlužování telomer rychle se dělících nádorových buněk. Dále jsou v teoretické části shrnuty možnosti testování viability. Cílem experimentální části bylo porovnání cytotoxické aktivity mezi komerčně dostupnými chemoterapeutiky a vybranými ligandy interagující s G-kvadruplexy. Dalším úkolem bylo studium apoptózy a nekrózy po působení vybraných chemických látek na buněčné linie a následně proběhla i lokalizace ligandů interagujících s G-kvadruplexy v buňkách nádorové buněčné linie karcinomu prsu. V rámci experimentální části bylo zjištěno, že ligandy interagující s G-kvadruplexy vykazují podobnou cytotoxickou aktivitu jako komerčně dostupná chemoterapeutika.
|
|
|
Preparation and expression of p53 protein isoforms using the GATEWAY expression system
Wikarská, Monika ; Hrstka, Miroslav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The TP53 gene can express protein p53 and 11 another isoform proteins N- and/or C-terminally truncated by using two promoters and alternative splicing. The p53 isoforms are found in both healthy and tumorous tissues, and are intensively studied in relation to cancer diagnosis, prognosis and treatment. In this work, the p53 isoforms were subcloned into expression vectors by LR reaction adapted from Gateway cloning system. The expression vectors were designed for protein production by bacteria E. coli strain BL-21. The constructs containing p53 isoforms were encoded together with two fusion proteins, glutathione-S-transferase and polyhistidine tag under the control of the same promotor for the affinity chromatography protein isolation. All the clones underwent Sanger sequencing for verification after homologous recombination. Sequencing confirmed the accuracy of the subcloned isoforms p53, 133p53, 160p53, p53 and 160p53 into an expression vector pDEST15-N6xHis-GST-GW-DEST. Protein 160p53 was expressed in BL-21 and isolated using both HIS and GST tag interacion. Isolation using HIS tag yielded in a higher protein concentration then the isolation mediated by the interaction of the glutathione-S-transferase.
|
|
|
Použití vysokorozlišovací analýzy křivek tání ke studiu baktérií mléčného kvašení
Knápková, Monika ; Němcová, Andrea (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V současné době roste zájem o užívání probiotických výrobků a na trhu je jich celá řada. S rostoucím zájmem je kladen i větší důraz na identifikaci deklarovaných probiotických mikroorganismů. Přesná identifikace mikrobiálního složení je často nelehkým úkolem a je zapotřebí pokročilejších metod, zejména z oblasti molekulární diagnostiky. Diplomová práce byla zaměřena na ověření přítomnosti deklarovaných probiotických mikroorganismů v probiotických doplňcích stravy GS Laktobacily Forte 21, Biopron 9 Premium a Linex® Forte. DNA byla z komplexních matric izolována fenolovou extrakcí, komerčním kitem a magnetickými nosiči F79/L3-PLL v kvalitě vhodné pro PCR. Následně byla izolovaná DNA amplifikována polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase s využitím rodově a druhově specifických primerů. Specifický PCR produkt byl podroben agarózové gelové elektroforéze, přičemž druhová identifikace nebyla vždy v souladu s údaji deklarovanými výrobci. Další část práce se zabývala polymerázovou řetězovou reakcí s vysokorozlišovací analýzou křivek tání za účelem rozlišení bakteriálních kmenů patřících do skupiny Lactobacillus a za účelem identifikace probiotických mikroorganismů přítomných ve směsi v probiotických doplňcích stravy. Bylo testováno osm sad primerů (V1F HRM a V1R-HRM, CHAU-V3F a CHAU-V3R, CHAU-V6F a CHAU-V6R, LAC2 a LAC4, LAC1 a LAC2, P1V1 a P2V1, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT). Jako nejvhodnější pro rozlišení bakteriálních kmenů rodu Lactobacillus byly vyhodnoceny tři dvojice primerů (V1F HRM a V1R-HRM, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT).
|
|
|
Využití různých metod izolace DNA baktérií mléčného kvašení v molekulárně biologických metodách
Chvalkovská, Eva ; Skoumalová, Petra (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Předkládaná práce se zabývá probiotickými bakteriemi, izolací DNA z těchto baterií třemi různými metodami a vlivu izolace na identifikaci DNA pomocí molekulárně biologických metod. Probiotické bakterie jsou důležitou součástí trávícího traktu člověka. Mají důležitou roli pro funkci imunitního systému, a to díky adhezi na sliznici trávícího traktu, kde vytváří nehostinné prostředí pro patogeny. Probiotické baterie přijímáme běžně v potravě, ať už v mléčných výrobních nebo pomocí doplňků stravy. Díky nadužívání antibiotik ovšem hrozí riziko předání vnitřní rezistence, kterou probiotické bakterie mají kvůli udržení přirozené homeostáze trávícího traktu, patogenním bakteriím. Je tedy důležité efektivně identifikovat rizikové probiotické bakterie, které mají schopnost rezistenci přenášet a eliminovat tak jejich přítomnost v potravinách a potravinových doplňcích. V experimentální části byly zkoumány tři metody izolace DNA, metoda fenolové extrakce, izolace magnetickými částicemi a izolace komerčním kitem. DNA byla izolovaná ze tří doplňků stravy a to Biopron 9 premium, Linex forte a GS Laktobacily forte 21. Čistota a koncentrace izolované DNA byla zjištěna spektrofotometricky. Přítomnost jednotlivých kmenů DNA v potravinových doplňcích byla potvrzena metodou polymerázové řetězové reakce v reálném čase. Jako nejlepší metoda izolace, co se týče čistoty a koncentrace izolované DNA byla na základě RT–PCR a spektrofotometrie vyhodnocena metoda izolace komerčním kitem.
|
host ::
RSS.