|
|
Studium mechanismu rozpoznávání DNA transkripčním faktorem FOXO4
Zusková, Iva ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Bouřa, Evžen (oponent)
Forkhead transkripční faktor FOXO4 se podílí na kontrole řady buněčných dějů, jako jsou např. metabolismus, buněčný cyklus, apoptóza, oprava poškozené DNA či ochrana vůči oxidativnímu stresu. Krystalová struktura DNA-vazebné domény tohoto proteinu s navázanou DNA ukázala, že FOXO4 interaguje s DNA podobně jako jiné forkhead proteiny. DNA- vazebný povrch je tvořen zejména helixem H3, který se váže do velkého žlábku molekuly DNA, a dále N-koncovým segmentem a flexibilními ohyby na C-konci domény. Nicméně řada otázek, zejména ohledně mechanismu regulace specifičnosti při rozpoznávání DNA a úlohy jednotlivých částí domény v tomto procesu, zůstává stále nejasná. V rámci této diplomové práce byla studována interakce DNA-vazebné domény FOXO4 s DNA o různých sekvencích. Tento protein a řada jeho mutantů byla exprimována a purifikována a interakce s DNA byly studovány pomocí metod fluorescenční spektroskopie a resonance povrchového plasmonu. Výsledky těchto experimentů ukázaly, že nukleotidová sekvence na 5′ konci od hlavního vazebného motivu ovlivňuje stabilitu komplexu DNA-vazebné domény FOXO4:DNA. Dále se podařilo objasnit význam jednotlivých aminokyselin FOXO4, které se podílejí na vazbě na DNA, na stabilitě výsledného komplexu.
|
|
|
Určení trojrozměrné struktury helikální domény proteinu Ddi2 (DNA damage-inducible protein 2)
Staníček, Jakub ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Lidský Ddi2 protein a jeho homology jsou málo prozkoumanou skupinou UBL/UBA proteinů obsahujících navíc doménu, jejíž struktura je příbuzná s dimerními aspartátovými proteasami retrovirů. Nejprozkoumanějším homologem je Ddi1 ze Saccharomyces cerevisiae, protein fungující v rámci ubikvitin-proteasomového systému. Tento klíčový buněčný systém využívá přísně regulovaný enzymatický aparát k vysoce selektivním posttranslačním modifikacím proteinů pomocí ubikvitinu. Ten následně funguje jako nitrobuněčný signál, rozhodující o dalších osudech označeného proteinu, přičemž nejčastějším důsledkem ubikvitinace bývá proteasomální degradace. Ddi1 v tomto kontextu zřejmě hraje roli adaptoru, napomáhajícího vazbě ubikvitinovaného substrátu na proteasom. Ač je funkce adaptoru v ubikvitin-proteasomovém systému možná i v případě lidského Ddi2, vzhledem k evolučním proměnám může být jeho úloha značně pozměněna. Jedním z důležitých bodů pro pochopení nitrobuněčné role Ddi2 je odhalení funkce jeho jednotlivých domén. Tato práce se zabývá strukturní analysou části proteinu Ddi2 přímo sousedící s proteasovou doménou, kde se nachází helikální oblast nazvaná HDD doména. Tato část byla naklonována, exprimována a změřena pomocí NMR spektroskopie. Strukturní data založená na údajích z NMR byla dále využita ke strukturním...
|
|
|
Studium struktury komplexu 14-3-3:fosducin.
Kacířová, Miroslava ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent)
Předkládaná diplomová práce se zabývá biofyzikální charakterizací komplexu dvou regulačních proteinů, fosducinu (Pd) a 14-3-3. Oba proteiny jsou zapojeny do regulační kaskády přenosu signálu v oční sítnici obratlovců. Pd je 33kDa protein nacházející se ve fotoreceptorových buňkách sítnice, ale také i v jiných tkáních. Za jeho hlavní funkci v oku se považuje regulace přenosu signálu jdoucího z oka k očnímu nervu, jako odpověď na ostré světlo, a to vazbou Gtβγ podjednotky heterotrimerního transducinu, jež je součástí tzv. G-proteinové signální dráhy. Vazba znemožní spojení Gtβγ s Gtα transducinu, což zabrání dalšímu přenosu signálu. Dysfunkce Pd by v důsledku dopadu intenzivního světla vedla k poškození sítnice. Dále se také zjistilo, že Pd ovlivňuje hypertensi a to tak, že snižuje krevní tlak u lidí a myší ve spánku. Ve tmou adaptované sítnici je funkce Pd regulována 14-3-3 proteinem. 14-3-3 je 28kDa protein nacházející se v mnohých tkáních eukaryot, především v mozku, a hrající roli v mnohých biochemických procesech, např. apoptose. Role 14-3-3 v sítnici oka spočívá ve vazbě fosforylovaného Pd, jeho udržení ve vnitřním segmentu tyčinek a zabránění tak jeho vazbě s Gtβγ, čímž se zajistí další možnost přenosu signálu k očnímu nervu. Pro vazbu je nutná fosforylace Pd na Ser54 a Ser73. Tvorba...
|
|
|
The effect of amino acid repertoire on protein structure and function
Treťjačenko, Vjačeslav ; Hlouchová, Klára (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Pačes, Jan (oponent)
Porozumění původu prvotních proteinů je pochopením přechodu komplexních chemických směsí k prvním biologickým systémům. Prvotní proteiny byly pravěpodobně strukturně flexibilní, s promiskuitní aktivitou a se sekvencemi představujícími spíše fyzikálně chemické vlastnosti než definované sekvenční motivy. Rané proteiny byly rovněž pravděpodobně složeny pouze z prebioticky dostupných aminokyselin z endogenních a exogenních zdrojů. V této práci jsme se zaměřili jak na studium vlivu nejpozdějších přírůstků aminokyselinového repertoáru na strukturu a funkci proteinů tak na charakterizaci nahodných sekvencí jakožto prekurzorů pro vznik nejranějších tak i současných proteinů generovaných z původně transkripčně/translačně neaktivních oblasti genomu. Výzkum náhodných proteinů je obzvlášt zajimavý z pohledu neprobádáné strany světa proteinových sekvencí. V této práci jsme charakterizovali in silico soubor náhodných proteinových sekvencí s přirozenými výskyty aminokyselin pomocí predikce sekundárních struktur/proteinové nesupořádánosti/agregace a rovněž jsme vybrali 45 sekvencí pro následující in vitro charakterizaci. Pomocí analýzy in silico knihovny jsme mohli konstatovat, že výskyt sekundárních struktur v náhodném sekvenčním prostoru není výrazně odlišný od toho v přírodních proteinech. Na druhou stranu,...
|
|
|
Studium strukturních rozdílů mezi izoformami 14-3-3 proteinů.
Macáková, Eva ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Gryčová, Lenka (oponent)
Proteiny 14-3-3 jsou regulační proteiny, které se vyskytují v mnoha isoformách ve všech eukaryotických organismech a účastní se řady buněčných dějů. V této práci jsem se zabývala vlivem struktury ohybu H8-H9 u ječmenných isoforem hv 14-3-3A a lidských isoforem 14-3-3ζ na afinitu k vazebnému partnerovi. Z dříve publikovaných výsledků vyplývá, že isoforma hv 14-3-3A se váže s nejmenší afinitou, což může být způsobeno přítomností glycinu v H8-H9 ohybu, na rozdíl od ostatních isoforem, které mají na stejné pozici serin. Vazebnou afinitu jsem zjišťovala jak pro původní protein hv 14-3-3A WT, tak i pro jeho mutant, u kterého byl glycin v H8-H9 ohybu nahrazen serinem. Pro srovnání jsem také provedla měření s lidskou isoformou 14-3-3ζ WT, která v H8-H9 ohybu na studované pozici obsahuje serin, a jejího mutantu, u kterého byl tento serin nahrazen glycinem. Proteiny jsem exprimovala v bakteriích E. coli kmen BL21(DE3) a poté jsem je purifikovala. Disociační konstanty pro vazbu peptidů pRaf značenými sondami FITC a ATTO jsem získala pomocí metod fluorescenční korelační spektroskopie a stacionárního měření intenzity fluorescence. Z naměřených hodnot vyplývá, že v případě lidských i ječmenných isoforem došlo po mutaci ke zhoršení afinty k vazebnému partnerovi.
|
|
|
Molekulárně-dynamické simulace komplexů sestávajících z nukleových kyselin a proteinů
Hammer, Jiří ; Barvík, Ivan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Cílem této diplomové práce bylo studium interakcí proteinu Argonautu (Ago) s komplexy nukleových kyselin. Na základě krystalových struktur Argonautu (A. aeolicus, Aa-Ago) a popř. jeho domén (lidská PAZ doména, Hs-PAZ) bylo vyprodukováno dvanáct různých simulací. Prvé dvě využily modelu Aa-Ago s různými substráty: buď s DNA/RNA nebo RNA/RNA duplexem. Hlavní rozdíl byl pozorován při interakci PAZ domény (resp. jejích argininových reziduí), která tolerovala guide DNA, nikoli však guide RNA vlákno. To naznačuje možnou funkci PAZ domény při rozpoznávání duplexů RNA/RNA od hybridních duplexů DNA/RNA. V dalších simulacích (3-9) byla využita Hs-PAZ doména. Žádné konflikty s guide DNA vláknem nebyly pozorovány. Byla vyzkoušena různá uspořádání aktivního místa, počet iontů a jejich parametrizace. DD-katalytický motiv s D683 (ekviv. lidskému H807 z Ago2) koordinoval (jeden, popř. dva) ionty Mg2+. Vysoce konzervovaná rezidua R570 a E578 stabilizovala aktivní místo vzájemnou vodíkovou vazbou. Z hlediska nevratnosti procesu přeštípnutí mRNA může hrát důležitou úlohu první (nepárový) nukleotid z 5'-konce guide DNA. Tato úloha by spočívala v tvorbě vodíkového můstku s přeštípnutým vláknem mRNA vedoucí k jeho destabilizaci. Simulace (10-12) s homologními modely lidských Ago2 se ukázaly jako málo stabilní a věrohodné...
|
|
|
Harnessing soluble forms of NK cell receptors and their ligands for cancer immunotherapy
Kalousková, Barbora ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Maloy Řezáčová, Pavlína (oponent)
Přirozeně zabíječské buňky, také NK buňky (z angl. natural killer cells, NK cells) jsou skupinou lymfocytů s přirozenou schopností zabíjet infikované, poškozené nebo maligně transformované buňky. Jelikož jsou tyto lymfocyty součástí přirozené imunity, jsou cytotoxické mechanismy aktivovány po rozpoznání specifických buněčných znaků, avšak bez předchozího kontaktu s antigenem. Toto rozpoznání je důležité pro NK buněčnou funkci při udržování homeostázy a imunitního dohledu. NK buňky cílí přímo na maligně transformované buňky, účastní se však také komplexní imunitní odpovědi, a to produkcí cytokinů nebo komunikací s ostatními imunitními buňkami. Na rakovinu můžeme nahlížet jako na prolomení imunitních bariér, kdy maligní buňky uniknou imunitě a zaplaví okolní tkáň, přičemž si kolem sebe vytváří mikroprostředí podporující růst nádoru. Tento proces může být zvrácen imunoterapií, tedy zásahem do formování imunitní odpovědi, což může vest k obnovení imunitního rozpoznávání. NK buňky jsou v imunoterapii důležitými efektorovými buňkami, mohou být použity pro adoptivní transfer, geneticky modifikovány pomocí chimerních antigenních receptorů nebo aktivovány příslušnými protilátkami. NK buněčné receptory, zodpovědné za rozpoznání cílových buněk a aktivaci cytotoxických mechanismů, jsou také jedním z cílů...
|
|
|
Konformace adenylátcyklázového toxinu Bordetella pertussis.
Motlová, Lucia ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Tato práce se zabývá uspořádáním RTX ("Repeats in ToXin") domén vybraných RTX toxinů a vlivem těchto struktur především na balení toxinů do nativní struktury jejich sekreci a. Pro strukturní analýzu byly vybrány RTX domény ApxI (Actinobacillus pleuropneumoniae-RTX- toxin I) z bakterie Actinobacillus pleuropneumoniae, HlyA (Alfa-hemolysin) z bakterie Escherichia coli a LtxA (Leukotoxin A) z bakterie Aggregatibacter actinomycetemcomitans a bloky 4 a 5 RTX domény CyaA (adenylátcyklázový toxin) z bakterie Bordetella pertussis. Podařilo se získat a charakterizovat struktury RTX domény Ltxa A a RTX bloky 5 a 4-5 CyaA. Na základě SAXS (maloúhlový RTG rozptyl) modelu, dříve vyřešených struktur RTX proteinů a zde prezentovaných struktur byly vytvořeny dva modely celé rozsáhlé RTX domény CyaA.
|
|
|
Strukturní charakterizace lidské proteinkinasy CaMKK2 a jejích interakcí s vazebnými partnery
Koupilová, Nicola ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
4 Abstrakt Ca2+/kalmodulin-dependentní proteinkinasa kinasa 2 (CaMKK2) patří do rodiny serin/threonin proteinkinas, které se účastní vápníkové signální dráhy. Při zvýšení intracelulární koncentrace vápenatých kationtů dochází k aktivaci kalmodulinu (CaM), který následně aktivuje své vazebné partnery, mezi které patří CaMKII, CaMKIII, CaMKK1 a CaMKK2. CaMKK2 následně aktivuje prostřednictvím fosforylace proteinkinasy CaMKI, CaMKIV a AMP-dependentní kinasu, AMPK. Přirozeně se v buňkách CaMKK2 vyskytuje v autoinhibovaném stavu, který je způsobený sterickým bráněním aktivního místa autoinhibiční doménou. Při vazbě s kalmodulinem dochází k odklonění autoinhibiční domény a tím ke zpřístupnění aktivního místa. Po aktivaci dochází u CaMKK k autofosforylaci a tím ke zvýšení aktivity. Negativní regulace je způsobena fosforylací cAMP-dependentní proteinkinasou A (PKA) a GSK3. Pro CaMKK1 i CaMKK2 byla identifikována místa, která jsou fosforylována PKA. Dvě z nich jsou součástí vazebného motivu pro proteiny 14-3-3. Předchozí studie ukázaly, že protein 14-3-3 udržuje fosforylovanou CaMKK2 v inhibovaném stavu tím, že brání defosforylaci S495, který blokuje vytvoření vazby s kalmodulinem. Nicméně je nejasné, jestli je to jediná úloha proteinu 14-3-3 v regulaci CaMKK2. Hlavním cílem této diplomové práce byla optimalizace...
|
|
|
Characterizing DDI2 protein interaction by solution NMR
Staníček, Jakub ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Lidský protein DDI2 je dimerní aspartátová proteasa, o které bylo nedávno zjištěno, že hraje důležitou roli při opravě poškození DNA a transkripční regulaci proteasomální exprese. Současné poznatky o molekulárních mechanismech obou funkcí jsou však stále poměrně omezené. Již dříve jsme identifikovali lidský protein RAD23B jako interaktant DDI2. RAD23B také funguje při opravě poškození DNA jako součást komplexu XPC, který stimuluje aktivitu opravy excize nukleotidů. Navíc se RAD23B účastní jako adaptorový protein v procesu degradace proteinů. Interakce DDI2 a RAD23B proto může mít důležité důsledky pro obě známé funkce DDI2. Tato práce popisuje interakci DDI2 a RAD23B na strukturální úrovni. Byly připraveny rekombinantní proteinové varianty DDI2 a RAD23B a interakce byla zmapována pomocí afinitní purifikace. K prozkoumání interakce byly dále použity NMR titrace. Klíčová slova: ubikvitin-proteasomální systém, oprava poškození DNA, regulace exprese proteasomu, aspartátová proteasa, DDI2, NMR (In Czech)
|
host ::
RSS.