|
Dynamics of selected DNA damage response proteins
Benada, Jan ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Kuthan, Martin (oponent)
Buněčná odpověd' na poškození DNA (DNA damage response) představuje kriti- cky důležitou signalizační sít', která ochraňuje celistvost genomu a brání vzniku rakoviny. Studium odpovědi na poškození DNA má tudíž zásadní klinický výz- nam a proteiny účastnící se této signalizace jsou slibnými cíli léčiv. Ačkoliv byly dosaženy značné pokroky v popisu interakcí jednotlivých proteinů této signali- zace, stále potřebujeme lépe porozumět komplexnímu chování celé signální sítě. Jedním z přístupů, který nám v tomto může pomoci, je popsání dynamiky klíčo- vých proteinů této signalizace v různých podmínkách. Prvním cílem této práce bylo popsat časovou dynamiku vybraných proteinů odpovědi na poškození DNA po různých genotoxických insultech, konkrétně po γ-ozáření a UV-C ozáření. Uká- zali jsme, že zatímco určité proteiny jsou aktivovány v jednom spojitém pulzu, jiné vykazují aktivaci v sérii pulzů. Na buněčné linii MCF7 jsme po γ-ozáření pozorovali již dříve popsané pulzy p53. Nicméně, na buněčné linii U2OS jsme po γ-ozáření detekovali spojitý nárůst hladin p53. Stejnou dynamiku p53 jsme pozorovali i po UV-C ozáření. Navrhujeme, že dynamika p53 závisí na účin- ném zapojení negativní zpětné vazby mezi kinázami aktivujícími p53 a fosfatázou Wip1. V druhé části této...
|
|
Cell signalling and molecular complexes of the TRH receptor
Drastichová, Zdeňka ; Novotný, Jiří (vedoucí práce) ; Hodný, Zdeněk (oponent) ; Říčný, Jan (oponent)
1 Souhrn První část disertační práce se zabývá identifikací proteinů isolovaných ve frakci obohacené o plasmatické membrány získané z buněčné linie HEK293-E2M11, jejichž hladina byla změněna po dlouhodobém působení thyroliberinu (TRH). Pomocí techniky imunoblotu se specifickými protilátkami proti Na,K-ATPase a vazebných pokusů s [3 H]TRH a [35 S]GTPγS bylo zjištěno, že frakce obohacená o plasmatické membrány obsahovala v porovnání s postnukleárním supernatantem výrazně vyšší množství Na,K-ATPasy, TRH receptoru and G-proteinů. Pro detekci a identifikaci proteinů ve frakci obohacené o plasmatické membrány, jejichž hladiny byly po dlouhodobém působení TRH (16 h; 10 μM) změněny, byly použity 2D elektroforéza a hmotnostní spektrometrie. Bylo identifikováno 42 proteinů, z nichž pět (mitofilin, MTHSP75, prohibitin, stomatin like-2, peroxiredoxin III) představuje mitochondriální proteiny, které jsou důležité pro zajištění správné struktury a funkce mitochondrií. Hladina těchto proteinů byla zvýšena po dlouhodobém působení TRH, a proto lze usuzovat, že dlouhodobé působení TRH může výrazně ovlivnit mitochondriální membránu a funkci mitochondrií. Druhá část disertační práce se zabývá identifikací molekulárních komplexů TRH receptoru a/nebo Gq/11 proteinu. Pomocí nativní elektroforézy byly identifikovány tři komplexy...
|
|
Role of STAT3 signalling in oncogenesis and cancer therapy
Machalová, Veronika ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent)
Velká pozornost je v dnešní době upírána na STAT3 (Signální transduktor a aktivátor transkripce 3) jako na možný cíl terapie rakoviny. Je dokázáno, že STAT3 je konstitutivně aktivován u mnoha typů rakoviny, jako je rakovina prsu či prostaty, a samotná tato konstitutivní aktivace stačí k rozvinutí nádorového bujení. Tento protein funguje jako transkripční faktor. Je aktivován fosforylací tyrosinu a následnou homodimerizací. Role STAT3 je nezastupitelná i v nenádorových buňkách; je transkripčním faktorem genů, jejichž proteinové přepisy se podílí na progresi buněčného cyklu, růstu a replikaci buňky, rovnováze mezi apoptotickými a anti-apoptotickými proteiny a dalších funkcích. Poměrně nově objevenou rolí STAT3 je modulace chodu mitochondrií a ochrana buňky před tvorbou kyslíkových radikálů. Tato bakalářská práce má za cíl shrnout podporující údaje, že STAT3 je perspektivním cílem nádorové terapie, a to zaměřením se na funkci tohoto proteinu v aspektech typických pro nádorové buňky. V této bakalářské práci je obsažena i kapitola věnovaná pokroku, kterého bylo dosaženo ve snaze vytvořit ideální STAT3 inhibitor. Klíčová slova: Signální transduktor a aktivátor transkripce 3 (STAT3), signální dráha JAK/STAT3, konstitutivní aktivace, rakovina, tumor, inhibitor, mitochondrie, apoptóza
|
|
Postranslational modifications in DNA damage response
Moudrý, Pavel ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent) ; Mistrík, Martin (oponent)
Náš genetický materiál je neustále vystavován působení mnoha faktorů a procesů, které představují enormní hrozbu pro naši schopnost přenášet genetickou informaci potomkům i pro naše vlastní přežití. Buňky mají mnoho mechanismů schopných detekovat a opravovat poškozenou DNA, souborně označovaných jako buněčná odpověď na poškození DNA (DDR). Aby došlo k optimalizaci oprav poškozené DNA a k potlačení jejích změn během normálních buněčných procesů, musí být DDR striktně regulována v čase i prostoru. Defekty v opravě DNA vedou ke genomové nestabilitě a v konečném důsledku až k rozvoji nádorových a neurodegenerativních onemocnění. Tato práce je kompilací výsledků čtyř projektů zaměřených na molekulární mechanismy buněčné odpovědi na poškození DNA a vytváření multiproteinových signalizačních a opravných komplexů v místech poškození DNA. Identifikovali jsme protein NUP153, který je součástí jaderného póru, jako nový faktor nezbytný pro jaderný import proteinu 53BP1 a buněčnou odpověd na poškození DNA. Ukázali jsme, že potlačení exprese NUP153 brání akumulaci proteinu 53BP1 v jádře nově utvářených dceřinných buňek, což vede k omezení akumulace proteinu 53BP1 v místech poškozené DNA indukovaných ionizujícím zářením, ke zpomalení oprav poškozené DNA, ke zvýšení citlivosti buněk k ionizujícímu záření a ke zhoršení...
|
|
Posttranslační modifikace proteinů účastnících se odpovědi na poškození DNA
Kroupa, Michal ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Novotný, Marian (oponent)
- 4 - Abstrakt V každé buňce vznikají denně tisíce poškození DNA, z nichž nejtoxičtější jsou dvouvláknové zlomy (double-strand breaks, DSBs). Signalizace jejich výskytu a následná oprava takto narušeného chromatinu je zprostředkována mechanismem odpovědi na poškození DNA (DNA damage response, DDR), který zahrnuje akumulaci mnoha efektorových proteinů do oblasti DSBs. Akumulace těchto molekul jsou označovány jako ložiska indukovaná poškozením DNA. DSBs jsou v závislosti na přítomnosti sesterské chromatidy opravovány dvěma hlavními mechanismy: homologní a nehomologní rekombinací. Obě tyto dráhy vedou k aktivaci Checkpoint kináz (Chk1 nebo Chk2), které zahajují přestávky v buněčném cyklu a umožňují tak opravu poškozené DNA. Signalizace poškození DNA a aktivace těchto drah jsou regulovány posttranslačními modifikacemi proteinů, což jsou enzymatické reakce zahrnující především fosforylaci, ubiquitinaci a nově objevenou sumoylaci. Nedávno bylo prokázáno, že ubiquitinace poškozeného chromatinu je nutnou podmínkou pro sumoylaci nádorových supresorů 53BP1 a BRCA1. Poruchy těchto modifikací nebo mutace genů pro 53BP1 a BRCA1 vedou k toleranci poškození DNA a následnému narušení genomové integrity, s čímž souvisí vysoké riziko pro selekci buněčných klonů s nádorovým potenciálem. Současné výzkumy se zaměřují na...
|
| |
|
Regulation of promyelocytic leukemia protein expression
Dobrovolná, Jana ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent) ; Kovarik, Pavel (oponent)
4. CONCLUSIONS Major resultsof this PhD thesiscanbe summarizedas follows: |. For full tÍanscTiptionalactivationof ISG @ML' Sp100'IRFI) by inteďeronor'the deaceýlationof unknownfactor(s)is necessary.IFNer.inducedexpressionof PML at mRNA andproteinlevel and zubsequentincreaseof PML NBs are suppressedby all tested HDACIs independentlyon cellular origin. Importantly,baml (i.e. IFNc- nonstimulated)expressionof PML is not influencedby ÍIDACIs. The classical Jak. STAT pathwaymediatingtransitionof IFNo signalremainsunaffectedby HDACIs and the targetof HDACIs lies downstreamof ISGF3 binding to PML promoter. AdverseaffectsofHDACIs usedin clinical praxisarepredicted. 2. Human mesenchymalstem cells (gfowing, confluent or terminally differentiated) expressPML protein,form PML nuclearboďes and respondto IFNcr teaEnent by dramaticelevationof PML mRNA andproteinlevels and mďerate increaseof PML NBs. Numberof PML NBs per cell nucleusis depende,nton thecultureproliferative age. ln normal diploid but not in immorbl cells PML forms various nucleoli- associatedshuctuÍes.The localization of PML into nucleoli is teestablishedin senescentcells. The importanc€ of PML association with nucleoli for its fumor suppressoractivitiesis hypothesized. 3. Drug-induced senescencein several human cell lines leads to increased PML...
|
|
Cytokine expression in chemically-induced senescence
Nováková, Zora ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Hampl, Aleš (oponent) ; Dvořák, Michal (oponent)
Souhrn Buněčná senescence, kerá dokáže potlačit nádorové bujení, představuje odpověď buněk na stres a poškození DNA a způsobuje zástavu proliferace. Na tomto ději se zřejmě podílejí i produkované cytokiny. V současné době se mnoho vědeckých skupin snaží stanovit povahu a funkci sekrečního fenotypu spojeného se senescencí. Bylo zjištěno, že prozánětlivé látky sekretované senescentními buňkami ovlivňují okolní buňky i své vlastní producenty. Tyto poznatky byly získány především na modelech replikativní a onkogenem indukované senescence. Úkol této práce spočíval v definování cytokinové produkce senescentními buňkami indukovanými genotoxickými látkami bromodeoxyuridinem a distamycinem A. V tomto modelu jsme zjistili trvale aktivovanou interferonovou signalizaci spojenou se zvýšením interferonových cílových genů zahrnujících PML, STAT1 a IRF1. Při testování více než 160 cytokinů a jejich receptorů jsme nalezli zvýšenou hladinu u více než dvaceti cytokinů zahrnující prozánětlivé faktory IL-1, IL-6 and IL-8. Domníváme se, že cytokinová signalizace spojená se senescencí vyvolavou chemikáliemi představuje složitý a robustní děj, který je udržován pozitivními zpětnými vazbami. Charles University in Prague Faculty of Sciences PML (promyelocytární leukemický protein) a PML tělíska hrají roli v potlačování...
|
|
The role of sumoylation in cellular senescence
Kopová, Ivana ; Švadlenka, Jan (oponent) ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce)
Organizmy so schopnosťou regenerácie tkanív potrebujú mechanizmy brániace vzniku rakoviny. Jedným z týchto mechanizmov je bunková senescencia, počas ktorej dochádza k trvalému zastaveniu bunkového cyklu poškodených, potenciálne nebezpečných buniek. V tejto práci sme ukázali, že 100 μM 5-bromo-2-deoxyuridín, 0,5 μM kamptotecín, 0,5 μM afidikolín a 2,5 mM tymidín spôsobujú chemicky indukovanú predčasnú senescenciu na rôznych ľudských rakovinových líniách, počas ktorej dochádza k zvýšeniu konjugácie izoforiem SUMO-2/3. Chemicky indukovaná predčasná senescencia zároveň spôsobuje formáciu fokusov SUMO-1 a SUMO-2/3, ktoré kolokalizujú s jadrovými telieskami PML. Ďalej sme popísali, že afidikolín indukuje predčasnú senescenciu v bunkách HeLa so stabilnou expresiou proteínu His6-SUMO-1. Bunková línia HeLa-His6-SUMO-1 má nižší počet teliesok PML, ktoré nekolokalizujú s fokusmi SUMO-2/3. Počet teliesok PML v bunkách HeLa s ektopickou expresiou proteínu His6-SUMO-1 sa počas afidikolínom indukovanej senescencie nezvyšuje. To znamená, že zvýšenie počtu teliesok PML nie je nutné k navodeniu afidikolínom indukovanej predčasnej senescencie. Absencia fokusov SUMO-2/3 a znížený počet teliesok PML podporujú teóriu, podľa ktorej proteín SUMO-1 pôsobí ako terminátor polymérnych reťazcov SUMO-2/3. Naproti tomu, v bunkách HeLa...
|
|
The role of DNA damage in cellular senescence
Dušková, Pavlína ; Vondrejs, Vladimír (oponent) ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce)
Cells grown in vitro may be introduced into terminal growth arrest termed cellular senescence. In normal cells, it always arises when they reach the end of their proliferative capacity. However, this process may be also caused by various means anytime during the cultivation of both normal and at some circumstances also in immortal cells. Current view of cellular senescence places this phenomenon into direct relationship with DNA damage. The first aim of this study is to elucidate the role of DNA damage in chemically induced senescence. Until recently, DNA damage was not studied in this particular model. All chemicals used in this work are routinely used to unveil unstable parts of the human genome, so called fragile sites, which are inherently prone to DNA breakage. The second aim of this study is to asses the possibility that these sensitive regions of DNA might be also involved in senescent phenotype. Two of the three chemicals used in this study, 5-bromodeoxyuridine and distamycin A, were commonly used to accomplish senescence, and their effect on main senescence-associated changes in cellular proteome is thus relatively well defined. The changes caused by the third compound, thymidine, were so far poorly investigated. Therefore, the last aim of this work is to find out, if the changes of protein...
|