|
|
Vliv cytochromu b5 na oxidaci naftalenu katalyzovanou lidským cytochromem P450 1A2
Stránský, Jaroslav ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Cytochromy P450 (CYP) jsou významnou skupinou enzymů ze třídy oxidoreduktas, které participují na biotransformaci celé řady endogenních i exogenních látek (xenobiotik). Negativním aspektem činnosti cytochromů P450 přitom může být tzv. bioaktivace, což je jev, kdy z původně netoxické (nebo jen málo toxické) látky vzniká látka mnohem toxičtější. Proto cytochromy P450 již dlouhodobě stojí v popředí vědeckého zájmu oboru biochemie a medicíny. Pro správnou funkci cytochromů P450 je nezbytné dodávání elektronů do katalytického cyklu. To zpravidla zajišťuje NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasa. Alternativním donorem elektronů však může být také cytochrom b5, který se u eukaryotických organismů, spolu s NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasou a cytochromy P450, nachází na membráně endoplasmatického retikula. Účast cytochromu b5 v katalytickém cyklu cytochromu P450 může mít na tento cyklus v určitých případech modulační efekt. V průběhu evoluce se vyvinulo mnoho isoforem cytochromů P450, které mají různé substrátové specifity, katalytické vlastnosti, zastoupení v tkáních apod. Předmětem zájmu této bakalářské práce je především isoforma 1A2 (CYP1A2) představující u člověka téměř 10 % celkových jaterních cytochromů P450. Její substrátová specifita se soustředí na široké spektrum látek zahrnující planární...
|
|
|
Příprava fúzních domén lidských imunoreceptorů pro jejich využití v imunoterapii
Cmunt, Denis ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Jednou z funkcí imunitního systému je imunitní dohled nad nádorově transformovanými buňkami, tedy schopnost takové buňky odstranit dříve, než se mohou stát škodlivými pro organismus. V případě, že se transformovaným buňkám podaří imunitnímu dohledu uniknout, dochází k rozvoji onkologického onemocnění. Nádorová imunoterapie spočívá v cílené stimulaci imunitního systému v boji proti nádoru. V poslední době se projevuje zájem o využití NK buněk v imunoterapii nádorů. Tyto buňky, patřící k nespecifické imunitě, se podílejí na imunitním dohledu. Při setkání s cílovou buňkou rozhoduje o aktivaci NK buňky integrace signálu z jejích povrchových aktivačních a inhibičních receptorů, které vážou ligandy na povrchu cílové buňky. V případě, že dojde k aktivaci NK buňky, spouští proti cílové buňce cytotoxickou odpověď. Využití NK buněk v imunoterapii zahrnuje mimo jiné testování bispecifických fúzních proteinů, které mohou jednou částí vázat povrchový nádorový antigen a druhou částí NK buněčný aktivační receptor, čímž zprostředkují kontakt obou buněk a vyvolají cytotoxickou odpověď. Tato práce představuje přípravu bispecifických fúzních proteinů sestávajících z aktivačního ligandu MICA (pro receptor NKG2D), nebo B7H6 (pro receptor NKp30) a nanoprotilátky cílící jeden ze tří nádorových antigenů HER2, CD20 a FGFR....
|
|
|
Studium metabolizmu karcinogenní a nefrotoxické přírodní látky aristolochové kyseliny II
Martináková, Lenka ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Aristolochové kyseliny (AA) jsou považovány za rostlinné toxikanty, které se přirozeně nacházejí v rostlinách čeledi Aristolochiaceae. Nejvíce zastoupenými kyselinami v uvedených rostlinách jsou aristolochová kyselina I (AAI) a aristolochová kyselina II (AAII). AA se považují za původce renálního onemocnění označovaného jako nefropatie vyvolaná aristolochovými kyselinami (AAN). AAN byla zpočátku objevena u pacientů jedné bruselské kliniky v Belgii zaměřené na redukci tělesné hmotnosti. Prvotní název onemocnění byl nefropatie vyvolána čínskými bylinami (CHN). Později se zjistilo, že při léčbě omylem došlo k záměně jedné složky použitého bylinného přípravku s rostlinou čeledi Aristolochiaceae. Druhý typ renálního onemocnění vyvolaného AA se označuje jako Balkánská endemická nefropatie (BEN), která byla vyvolána v důsledku kontaminace obilí oblasti podél řeky Dunaje v balkánských zemí právě rostlinami obsahujícími AA. Tato renální onemocnění (AAN i BEN) se často spojují s pozdějším nástupem urotheliální rakoviny horních močových cest (UUC). AA (AAI a AAII) v organizmech podléhají biotransformaci vedoucí k jejich redukční aktivaci nebo oxidační detoxikaci. Na jejich redukci participují jak cytosolární enzymy [NAD(P)H:chinon oxidoreduktasa], tak enzymy mikrosomální [cytochromy P450, NADPH:cytochrom P450...
|
|
|
Vliv inhibitorů tyrosinkinas na expresi biotransformačních enzymů
Dvořák, Josef ; Dračínská, Helena (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Nádorová onemocnění jsou jednou z nejčastějších příčin úmrtí u lidské populace. Jedním z mnoha možných důvodů vzniku nádorového bujení je abnormální funkce tyrosinkinas, které se podílejí na přenosu signálu a regulaci nejdůležitějších pochodů v buňce. Mezi tyto procesy patří kontrola buněčného růstu, dělení a buněčné diferenciace a apoptosy. Pro terapii nádorových onemocnění způsobených abnormální funkcí tyrosinkinas se vyvíjí jejich specifické inhibitory. K cílené léčbě nádorů štítné žlázy se nově používají inhibitory tyrosinkinas vandetanib a lenvatinib. V rámci této bakalářské práce byl zkoumán vliv vandetanibu a lenvatinibu na genovou expresi biotransformačních enzymů cytochromů P450 rodiny 2 (CYP2A2, CYP2B1, CYP2C11, CYP2D1, CYP2E1), protože se podílejí na biotransformačních reakcích velké části dostupných léčiv na trhu. Ke zkoumání relativní genové exprese CYP2 byla použita kvantitativní PCR vzorků cDNA syntetizovaných z izolované RNA z jater a ledvin potkanů vystavených výše zmíněným inhibitorům tyrosinkinas. Výsledky naznačují, že vandetanib ani lenvatinib nemají v tkáni jater a ledvin potkanů prokazatelný výrazný vliv na genovou expresi zkoumaných zástupců cytochromů P450 rodiny 2. KLÍČOVÁ SLOVA: genová exprese, cytochromy P450, lenvatinib, vandetanib , inhibitory tyrosinkinas
|
|
| |
|
|
Studium metabolismu dihydromyricetinu
Blecha, Tomáš ; Moserová, Michaela (vedoucí práce) ; Koblihová, Jitka (oponent)
V poslední době je věnována stále větší pozornost chemopreventivním sloučeninám, které běžně přijímáme v rostlinné stravě. Velkou skupinu chemopreventivních sloučenin představují flavonoidy, které jsou obsaženy v mnoha potravinových doplňcích. Jedním ze zástupců této skupiny je dihydromyricetin, kterému jsou přisuzovány pozitivní účinky na lidský organismus, především antioxidační, protizánětlivé a hepatoprotektivní. Některé flavonoidy mohou působit jako modulátory enzymů první a druhé fáze metabolismu cizorodých látek a jejich inhibicí či indukcí mohou zasáhnout do endogenního metabolismu. V první části předkládané diplomové práci byl studován vliv flavonoidních sloučenin biochaninu A, dihydromyricetinu, myricetinu a jejich kombinací na expresi cytochromu P450 2E1 (CYP2E1) a sulfotransferasy 1A1 (SULT1A1) v játrech a tenkém střevě laboratorního potkana. Tenké střevo bylo rozděleno na tři části, a to proximální, střední a distální. Nejprve byla provedena izolace celkové RNA, která byla převedena do cDNA za účasti náhodných hexamerů jako primerů. Pomocí kvantitativní PCR bylo zjištěno významné snížení exprese obou enzymů v játrech. K nejvýraznějšímu zvýšení hladiny mRNA dochází u obou enzymů v proximální části tenkého střeva všech premedikovaných potkanů. Exprese CYP2E1 byla signifikantně zvýšena ve...
|
|
|
Příprava nádorového ligandu B7-H6 s coiled-coil kotvou a ověření jeho vazby na receptor NKp30
Krejčová, Kateřina ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
NK buňky jsou přirozené zabíječské buňky (z angl. natural killer cells) podílející se na protinádorové imunitě. Tyto buňky jsou schopny zabránit vzniku virové infekce či nádorového onemocnění, a to bez předešlé senzitizace antigenem. Mechanismus aktivace NK buněk je založen na principu snížené exprese MHC gp I molekul na povrchu nádorových buněk. Na povrchu NK buněk jsou přítomny receptory, které jsou schopny rozlišit jak aktivační, tak inhibiční signály, které rozhodují o tom, zda dojde k aktivaci NK buněk a zabití cílové buňky, či nikoliv. NKp30 je transmembránový receptor I. typu, který rozeznává stresem indukovaný buněčný ligand B7-H6. Interakce těchto proteinů je signálem pro imunitní systém k zahájení imunitní odpovědi. Tato práce se zaměřuje na přípravu buněčného ligandu B7-H6 s peptidovou coiled- coil kotvou v liniích lidských embryonálních ledvinných buněk HEK293S GnTI- a HEK293T. Byl úspěšně připraven protein s coiled-coil kotvou na C-konci proteinu, což bylo ověřeno hmotnostní spektrometrií. Rovněž byla pomocí sedimentační analýzy potvrzena interakce připraveného proteinu s receptorem NKp30. Klíčová slova: NK buňky, rekombinantní exprese, B7-H6, HEK293, coiled-coil
|
|
|
Interakce střevní mikroflóry s myricetinem
Hušková, Andrea ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Střevní mikroflóra by se dala považovat za "zapomenutý" orgán lidského těla. V gastrointestinálním traktu se střevní mikroorganismy podílejí na přeměně cizorodých látek (včetně léčiv) na jejich aktivní či neaktivní metabolity, a tak ovlivňují jejich biologickou aktivitu. Různorodost mikroorganismů ve střevech rozličných hostitelů vede k rozdílným metabolickým reakcím cizorodých látek. Tato diverzifikace má přirozeně za následek různorodost výsledných metabolitů mezi hostitelskými organismy. Na tento fakt je potřeba se zaměřit při studování a testování nových léčiv a taktéž potravních doplňků, jejichž mikrobiální metabolity, hlavně při orálním podání, mohou mít závažné následky pro hostitelský organismus. V této práci byla sledována vzájemná interakce myricetinu s fekálními bakteriemi, které byly vystavovány různým podmínkám prostředí. Pro experimenty byla využita metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), pomocí které byla zjišťována rychlost degradace myricetinu a potenciální vznik dihydromyricetinu jako redukovaného metabolitu. Efekt myricetinu na růst fekálních bakterií byl studován technikou PCR-DGGE. Z izolované DNA bakterií byl metodou PCR amplifikován úsek DNA odpovídající 16S rRNA. PCR produkty byly následně separovány na denaturačním gradientovém polyakrylamidovém gelu....
|
|
|
Příprava delečních mutantů lidského cytochromu b5 pomocí genové syntézy
Kotlánová, Iveta ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Cytochrom b5 je malý amfipatický protein. Jeho lidská forma se nachází ukotvena ve vnější membráně endoplazmatického retikula a mitochondrií, volně se nachází v červených krvinkách. Skládá se ze dvou domén: Větší hydrofilní doména váže hem, menší hydrofobní doména ukotvuje cytochrom b5 v mikrosomální membráně. Obě domény jsou spojeny linkerem, což je řetězec asi 15 aminokyselin, který dodává proteinu potřebnou flexibilitu. Jeho délka hraje významnou roli při přenášení elektronů na cytochrom P450. Pokud je linkerová doména příliš krátká, cytochrom b5 nedokáže přenášet elektrony na cytochrom P450 a neúčastní se tak reakcí MFO systému. Ostatní funkce jsou však zachovány. Cílem této práce bylo navrhnout a pomocí genové syntézy vytvořit 4 deleční mutanty cytochromu b5. Jejich linkerová doména obsahovala krátké i dlouhé delece, u kterých se předpokládá narušení interakce s cytochromem P450. Součástí práce byla heterologní exprese proteinů pomocí buněk Escherichia coli kmenů XL10-Gold a DH5α. Jako expresní vektory pro transformaci byly použity plasmidy pET-30a(+) a pET-22b. DNA byla z buněk izolována a sekvenací byla ověřena správnost genetického kódu. Klíčová slova: cytochrom b5, heterologní exprese, genová syntéza
|
|
|
Studium vlivu flavonoidních látek na expresi biotransformačních enzymů
Koucká, Kamila ; Moserová, Michaela (vedoucí práce) ; Mrízová, Iveta (oponent)
Flavonoidy patří do skupiny fenolických látek řadící se mezi sekundární metabolity rostlin, které jsou zastoupeny převážně v ovoci a zelenině. Tyto látky vykazují antioxidační a anti-kancerogenní účinky. Některé z nich mohou mít vliv na biotransformační enzymy, mezi něž se řadí i cytochromy P450, a mohou tak ovlivňovat metabolismus xenobiotik. V předkládané bakalářské práci byl studován vliv dihydromyricetinu na genovou expresi cytochromu P450 1A1, 1A2 a cytochromu b5 v játrech, plicích, ledvinách, tlustém a tenkém střevě laboratorního potkana. Tenké střevo bylo rozděleno na tři části, a to proximální, střední a distální. Nejprve byla provedena izolace celkové RNA za využití komerčně dostupného činidla a dále byla izolovaná RNA převedena na cDNA metodou reverzní transkripce. Nakonec byla využitím polymerasové řetězové reakce v realném čase (RT-PCR) stanovena relativní genová exprese sledovaných genů v orgánech potkanů premedikovaných dihydromyricetinem a potkanů kontrolních, nepremedikovaných, vůči referenčnímu genu β-aktinu. Bylo zjištěno, že ve většině orgánů dihydromyricetin neměl signifikantní vliv na expresi sledovaných genů. Ovšem signifikantní snížení genové exprese CYP1A1 a CYP1A2 bylo zaznamenáno v plicích. Naopak nárůst genové exprese byl zjištěn v ledvinách v případě CYP1A2 a cytochromu...
|
host ::
RSS.