|
|
Etická problematika asistované reprodukce s důrazem na metody kryokonzervace
Zajíčková, Markéta ; Haškovcová, Helena (vedoucí práce) ; Křepelka, Petr (oponent) ; Teplá, Olga (oponent)
Lidská neplodnost není novým fenoménem, ale je stejně stará jako lidstvo samo. V současné době však ve většině vyspělých zemí stoupá počet párů, které mají problém s početím potomka. To je způsobeno mimo jiné i životním stylem spojeným s budováním kariéry a odkládáním rodičovství. Zatímco v minulosti neplodné páry měly obvykle jen dvě možnosti jak řešit svoji sterilitu - bezdětností a náhradním životním programem, nebo osvojením dítěte. Dnes mají neplodné páry ještě třetí možnost, kterou je léčba neplodnosti pomocí metod asistované reprodukce. Letos uplynulo přesně čtyřicet let od okamžiku, kdy se narodilo první dítě pomocí mimotělního oplodnění. Již tehdy byla asistovaná reprodukce považována za metodu, která je eticky problematická. Na hledání východisek etických problémů se podílela a stále podílí celá řada odborníků, např. lékaři, biologové, právníci, filozofové, teologové a další. Nejen, že u některých problémů nebylo za celou dobu existence asistované reprodukce nalezeno řešení, na němž by se většina odborné i laické veřejnosti shodla, ale s postupným vývojem této léčebné metody vznikají problémy nové. Dnešní stupeň vývoje jednotlivých technik a postupů umělého oplodnění spolu s moderními farmaceutickými přípravky umožňují mít vlastní dítě i osamělým ženám bez partnera, homosexuálním párům a...
|
|
|
Vliv nového kryokonzervačního protokolu na imunogenicitu a rejekci tepenných aloštěpů u potkanů
Hrubý, Jan ; Matia, Ivan (vedoucí práce) ; Oliverius, Martin (oponent) ; Štádler, Petr (oponent)
SOUHRN Cílem předložené experimentální práce bylo studovat na potkanním modelu akutní buňkami a protilátkami zprostředkovanou imunitní reakci u příjemců štěpů břišní aorty ošetřených novým standardizovaným klinickým kryokonzervačním protokolem s pomalým rozmrazováním používaným v "Programu transplantace cévních štěpů v České republice". Dalším cílem naší práce bylo porovnat vliv dvou základních typů konzervačních protokolů používaných v tomto programu (kryokonzervační protokol s pomalým rozmrazováním a protokol konzervace chladem) na akutní imunitní reakci po transplantaci takto ošetřených štěpů břišní aorty u potkanů. Kryokonzervované štěpy břišní aorty jsme transplantovali syngenně mezi potkany kmene Lewis (skupina CRYO-ISO, doba kryokonzervace 172,6 dnů) a alogenně mezi potkany kmenů Brown - Norway a Lewis (skupina CRYO-ALO, doba kryokonzervace 179,3 dnů). Štěpy jsme explantovali 30. pooperační den a následně vyšetřili histologickými a imunohistochemickými metodami se zaměřením na typické známky akutní rejekce ve třech základních vrstvách aortální stěny. Sledovali jsme přítomnost endotelových buněk, známky intimální hyperplázie, šířku tunica media, přítomnost nekróz a ukládaní protilátek třídy G v této vrstvě, počet CD4+, CD8+ a LEW MHC II+ imunokompetentních buněk v adventiciální vrstvě aortální stěny....
|
|
|
Imunosuprese po transplantaci kryokonzervovaných tepenných alloštěpů v experimentu.
Špunda, Rudolf ; Špaček, Miroslav (vedoucí práce) ; Moláček, Jiří (oponent) ; Rohn, Vilém (oponent)
SOUHRN Cílem experimentální práce bylo zhodnocení vlivu imunosuprese pomocí takrolimu na rejekci kryokonzervovaných aortálních alloštěpů na potkaním modelu, který byl nastaven tak, aby simuloval techniky a postupy používané v klinickém programu transplantace kryokonzervovaných tepenných alloštěpů. Kryokonzervované alloštěpy abdominální aorty jsme transplantovali mezi kmeny potkanů Brown-Norway a Lewis. Imunosupresi pomocí takrolimu v dávce 0,2 mg/kg/den jsme podávali intramuskulárně od 1. (skupina TAC1), respektive od 7. (skupina TAC7) do 30. pooperačního dne. Neimunosuprimované skupiny po isogenní (ISO) a allogenní (ALO) transplantaci sloužily jako kontrola. Třicátý den po transplantaci jsme štěpy explantovali, histologicky a imunohistochemicky jsme zhodnotili destrukci cévní stěny a infiltraci imunokompetentními buňkami. Dále jsme hodnotili koncentraci donor specifických anti-MHC protilátek v periferní krvi. Cévní stěny alloštěpů v obou imunosuprimovaných skupinách nejevily 30. pooperační den žádné známky destrukce a nebyla v nich zaznamenána žádná depozita imunoglobulinu G. Adventiciální infiltrace MHC II pozitivními buňkami byla ve skupině ALO signifikantně vyšší než u obou imunosuprimovaných skupin (ALO 20,7±6,7, TAC1 5,9±5,5, TAC7 6,1±5,1, P <0,001). Koncentrace anti-MHC protilátek I. a II. třídy byla...
|
|
|
Úloha některých proteinů při zmrazování spermatu ryb
XIN, MiaoMiao
Poškození spermií během kryokonzervace je považováno za hlavní překážku expanze technologie uchovávání spermatu ryb. Precizní znalost kryokonzervace spermatu a kryoprotektantů s ohledem na kvalitu rybích spermií může rozšířit budoucí využívání této technologie. Pro zlepšení kvality zmrazených a rozmrazených spermií byly použity antifreeze proteiny jako kryoprotektivní látky spolu s optimalizací protokolů kryokonzervace. Nejprve byla popsána vitrifikace jako slibná kryokonzervační technika pro uchovávání rybích spermií. Tradiční vitrifikace vyžaduje prudké zmrazení/rozmrazení, malé nosiče vzorků s použitím permeabilních kryoprotektantů o vysokých koncentracích, a to k vitrifikaci jak intra, tak extracelulárních kapalin. Nicméně vitrifikace rybích spermií je nepoužitelná v praktické akvakultuře, protože se používají permeabilní kryoprotektanty s cytotoxickými účinky na buňky. Množství permeabilního kryoprotektantu však může být sníženo nebo eliminováno použitím zařízení nebo technik, které dramaticky zvyšují míru zmrazení/rozmrazení ošetřením mnohem menšího množství spermií. Vitrifikace může být tudíž vhodnější pro ryby produkující malé množství koncentrovaného spermatu, ale není vhodná u jeseterů produkujících velké množství spermií s nízkou koncentrací ve srovnání s kostnatými rybami. Dále byly využity proteomické metody pro charakterizaci proteinového profilu u spermií a v semenné plazmě a studován jejich vliv na funkci spermií při konvenční kryokonzervaci. Dále byly zkoumány změny v motilitě spermií jesetera malého během kryokonzervace. Míra motility spermií jesetera malého významně poklesla po kryokonzervaci spermatu, kdežto u čerstvých a zmrazených spermií nebyl zjištěn rozdíl v průměrné nelineární rychlosti. Změna v proteinovém profilu po zmrazení byla zaznamenána celkem u šesti proteinů v semenné plazmě a u třinácti v případě spermatu. Mezi nimi bylo pozitivně identifikováno osm proteinů: a) dva (mitochondriální podjednotka ATP syntházy alfa a protein tepelného šoku 70) pocházející ze semenné plazmy, spojené s metabolismem a odpovědí na stres; b) čtyři (triosefosfát izomeráza, mitochondriální ATP syntházová podjednotka ?, glycerol-3-fosfátdehydrogenáza [NAD (+)], enolasa B) ve spermiích se podílejí na metabolických drahách jako je glukoneogeneze a glykolýza a zajišťují účinnou energii pro pohyb spermie; c) další dva (řetězec ? tubulinu a řetězec tubulinu ?, specifický pro testes) ve spermiích jsou hlavními složkami mikrotubulů spermií, které hrají důležitou roli v organizaci cytoskeletu mikrotubulu. Dosažené výsledky rozšiřují znalosti v proteinovém složení spermatu během kryokonzervace, souvisejících s jejich poškozením během zmrazení, což může pomoci určit funkci těchto změněných proteinů a poskytnout nové představy o tom, jak zlepšit kryokonzervaci spermií. Je známo, že kryokonzervace způsobuje letální a subletální poškození spermií, proto byly dále použity během kryokonzervace různé koncentrace antifreeze nemrznoucích proteinů (AFPI nebo AFPIII) jako kryoprotektantů. Analýza průtokovou cytometrií ukázala, že přidáním nemrznoucích proteinů došlo významně ke zlepšení membránové integrity spermatu jeseterů malých po kryokonzervaci s výjimkou koncentrace 0,1 ?g/ml AFPI. Ve zmrazených spermiích s přídavkem nemrznoucích proteinů však nebylo pozorováno žádné statistické zlepšení rychlosti motility, nelineární rychlosti, lineární rychlosti a fertility ve srovnání se spermiemi bez přídavku nemrznoucích proteinů. Z toho vyplývá, že přidávání nemrznoucích proteinů do kryokonzervačního média poskytuje určité ochranné účinky integritě plazmatické membrány spermií.
|
|
|
ADVANCES IN FISH SPERM CRYOPRESERVATION: TAXONOMICAL CONSIDERATION
STECHKINA, Taisiya
Tato práce je věnována zkoumání současného stavu kryokonzervace spermatu ryb ve vztahu k akvakultuře a ochranným opatřením se zvláštním zaměřením na taxonomii spermií ryb. Na základě intenzivní analýzy dostupné literatury na toto téma bylo zjištěno, že kryokonzervace je v současné době považována za jednu z důležitých složek efektivní strategie pro záchranu ohrožených druhů a také jako jedinečný nástroj, který lze využít v průmyslu akvakultury k usnadnění řízení chovů. Bylo shrnuto, že v současné době, byly s různým úspěchem kryokonzervované spermie z 233 paprskoploutvých ryb náležejících do 22 řádů, pomocí různých kryokonzervačních protokolů. Tyto údaje jsou prezentovány ve formě tabulky v příloze. Pro vytvoření této databáze byla jako základní zdroj informací použita vědecká citační služba Web of Science (Clarivate Analytics), následně doplněná knihovními zdroji. Ze získaných dat se předpokládá, že hlavní část studií byla zaměřena na ekonomicky významné druhy ryb a menší část studií byla zaměřena na ohrožené druhy ryb. Zvláště zajímavé je pozorování, že podobná metoda kryokonzervace může být aplikována s větším úspěchem u druhů ryb patřících do taxonomicky příbuzných skupin. Taxonomická diverzita ryb je spojena se specifickými morfologickými a fyziologickými vlastnostmi jejich gamet. To následně znamená, že je nutné vyvinout druhově specifické protokoly kryokonzervace spermatu pro druhy, které dosud nebyly studovány a jsou vystaveny riziku zániku. Taxonomická analýza ukazuje, že nejvyšší počet druhů ryb, jejichž spermie byly kryokonzervované, patří do řádu ostnoploutví (Perciformes), následuje máloostní (Cypriniformes), dále sumci (Siluriformes), trnobřiší (Characiformes), lososotvární (Salmoniformes) a halančíkovci (Cyprinodontiformes). Je třeba poznamenat, že tyto řády představují přibližně 33% existujících řádů ryb a nyní je zřejmé, že by měla být věnována větší pozornost vývoji protokolů pro zástupce řádů, které nejsou zapojeny do kryobiologických studií. Tato bakalářská práce poskytuje nejmodernější přehled druhů ryb, jejichž spermie byly kryokonzervovány, a tyto údaje mohou sloužit jako základ a bibliografický zdroj pro další výzkum kryobiologie rybích spermií.
|
|
|
Etická problematika asistované reprodukce s důrazem na metody kryokonzervace
Zajíčková, Markéta ; Haškovcová, Helena (vedoucí práce) ; Křepelka, Petr (oponent) ; Teplá, Olga (oponent)
Lidská neplodnost není novým fenoménem, ale je stejně stará jako lidstvo samo. V současné době však ve většině vyspělých zemí stoupá počet párů, které mají problém s početím potomka. To je způsobeno mimo jiné i životním stylem spojeným s budováním kariéry a odkládáním rodičovství. Zatímco v minulosti neplodné páry měly obvykle jen dvě možnosti jak řešit svoji sterilitu - bezdětností a náhradním životním programem, nebo osvojením dítěte. Dnes mají neplodné páry ještě třetí možnost, kterou je léčba neplodnosti pomocí metod asistované reprodukce. Letos uplynulo přesně čtyřicet let od okamžiku, kdy se narodilo první dítě pomocí mimotělního oplodnění. Již tehdy byla asistovaná reprodukce považována za metodu, která je eticky problematická. Na hledání východisek etických problémů se podílela a stále podílí celá řada odborníků, např. lékaři, biologové, právníci, filozofové, teologové a další. Nejen, že u některých problémů nebylo za celou dobu existence asistované reprodukce nalezeno řešení, na němž by se většina odborné i laické veřejnosti shodla, ale s postupným vývojem této léčebné metody vznikají problémy nové. Dnešní stupeň vývoje jednotlivých technik a postupů umělého oplodnění spolu s moderními farmaceutickými přípravky umožňují mít vlastní dítě i osamělým ženám bez partnera, homosexuálním párům a...
|
|
|
Potenciál cholesterolem obalených cyklodextrinů a nízkodenzitního lipoproteinu pro zvýšení účinnosti kryokonzervace epididymálních spermií hřebců
Janošíková, Martina ; Rajmon, Radko (vedoucí práce)
V případě náhlého úmrtí, nutné kastrace nebo poranění reprodukční soustavy hřebce, znemožňující odběr ejakulátu, lze pro zachování genetického potenciálu výjimečných jedinců využít epididymálních spermií. Prakticky jediným způsobem, jak dlouhodobě uchovat fertilizační potenciál spermií, je kryokonzervace. Tento proces však navozuje nevratné změny, které jsou příčinou sníženého počtu oplození schopných spermií po rozmrazení. Epididymální spermie mají jiné vlastnosti než ejakulované a hůře se uchovávají. Proto se neustále hledají způsoby, jak jejich kryokonzervaci zefektivnit.
Obecně nejpoužívanějšími kryoprotektanty jsou glycerol a vaječný žloutek. Navzdory pozitivním účinkům je glycerol pro buňky toxický a vaječný žloutek obsahuje i složky, které působí na metabolismus spermií negativně. Zvýšení efektivity kryokonzervačních protokolů by se pravděpodobně dalo dosáhnout náhradou toxických komponent při současném využití průmyslově vyráběných účinných frakcí žloutku.
Předkládané téma disertační práce se bude zabývat použitím cholesterolem obalených cyklodextrinů spolu s nízkodenzitními lipoproteiny při kryokonzervaci epididymálních spermií.
Hlavní metody: HPLC, Western blot, elektroforéza, fluorescenční značení, počítačem asistovaná analýza spermií(CASA).
|
|
|
Apoptické změny v kryokonzerovaném ejakulátu hřebců
Bubeníčková, Filipa ; Šichtař, Jiří (vedoucí práce) ; Jindřich, Jindřich (oponent)
Cílem práce bylo zhodnotit vliv času inkubace, použitých obalů, ředidel a individuality hřebců na výskyt apoptotických spermií v rozmražených inseminačních dávkách (ID).
Ejakulát byl odebrán od 6 starokladrubských hřebců standardním způsobem odběru. Odebrané ejakuláty byly ředěny dvěma typy žloutkocitrátových ředidel (GENT a LAKT) a plněny do 0,5 ml pejet a 5 ml hliníkových tub, ve kterých byly zmraženy a uchovávány v tekutém dusíku. Po rozmražení (37°C, 30-60 s.) byly ID hodnoceny na přítomnost apoptotických spermií ihned po rozmražení a v časech inkubace 15, 30, 45 a 60 minut po rozmražení s využitím fluorochromů Yo-Pro 1 a propidium jodidu a fluorescenčního mikroskopu.
Byl zjištěn statisticky významný rozdíl v zastoupení apoptotických spermií po rozmražení mezi ID ředěnými různým typem ředidla. V ID mražených v ředidle Gent bylo vyšší množství apoptotických i apoptotických spermií z celkového počtu živých, což naznačuje lepší přežívání spermií v tomto ředidle oproti laktózovému ředidlu. Byl prokázán vliv použitého obalu na přítomnost apoptotických spermií v ID po rozmražení. V 5 ml tubách bylo ihned po rozmražení statisticky významně vyšší průměrné zastoupení apoptotických spermií než v 0,5 ml pejetách. S postupujícím časem inkubace nebyly už rozdíly významné. Naopak procentuální zastoupení apoptotických spermií z celkového počtu živých bylo vyšší v 0,5 ml pejetách. Statisticky významný byl však tento rozdíl s 5 ml tubami zaznamenán až po hodinové inkubaci. Zásadní rozdíly byly patrné až při porovnání kombinací použitých ředidel a obalů. Jako nejlepší, s přihlédnutím hlavně k údaji procentuálního zastoupení apoptotických spermií z celkového množství živých, se zdá být použití ředidla Gent a 5 ml tub.
Významný vliv na zastoupení apoptotických spermií v kryokonzervovaných ID měla individualita hřebce. Pro zvýšení kvality produkovaných ID je třeba přistupovat ke každému hřebci individuálně, zvláště u plemen jako je starokladrubský kůň, u kterého vysoký stupeň inbreedingu může významně ovlivnit kvalitu ejakulátu a výslednou úspěšnost reprodukce.
|
|
|
Kryokonzervace spermií kapra obecného (Cyprinus carpio) při různých podmínkách zmrazování.
SOCHOROVÁ, Denisa
V této studii bylo zkoumáno několik různých zmrazovacích médií (kryoprotektantů), které již dříve byly vyzkoušeny různými autory, byly také vyzkoušeny různé zmrazovací protokoly pro zachování jednotlivých parametrů při zamrazování spermií. Byly prozkoumány účinky řízeného seedingu a změny rychlosti ochlazování v různých fázích zamrazování. Sperma bylo odebráno od 7 mlíčáků kapra obecného, které bylo zamrazeno v pejetách o objemu 0,5 ml. V objektu zájmu bylo porovnat čtyři zmrazovací protokoly, které byly na různých hladinách nad tekutým dusíkem (1, 3, 6, 9 cm) (což odpovídá -190 °C, -150 °C, -110 °C, -70 °C) po dobu 20 minut a následně byly přeneseny do tekutého dusíku. Nejvyšší přežití bylo dosaženo ve 3 cm nad hladinou tekutého dusíku (pohyblivost 33 ? 8 %) a rychlost pohyblivosti po rozmrazení spermií (118 ? 9 ?m/s). Bylo zjištěno, že teplota -90 °C je optimální, při které je vhodné ponořit vzorky do tekutého dusíku bez negativního vlivu pohyblivosti spermií po rozmrazení. Pohyblivost spermií ponořených do tekutého dusíku před nebo bezprostředně po bodu krystalizace (-16 °C) je 0 %. Pohyblivost spermií zmrazených za pomoci metody seedingu nebo bez použití této metody se po rozmrazení významně nelišila. Přechlazování vzorku během běžného zmrazovacího postupu není hlavní příčinou poškození spermií v průběhu zmrazování.
|
|
|
Kryokonzervace spermatu ryb na modelovém druhu kapra obecného (Cyprinus carpio): vliv různých teplotních režimů zamrazování na životnost spermií po rozmrazení.
SOCHOROVÁ, Denisa
V této studii byl sledován vliv teploty a rychlosti mrazení a následného rozmrazení na životnost spermií. Motilita (procento pohyblivých spermií), rychlost a doba pohybu spermií byla sledována u kapra obecného (Cyprinus carpio L.) před a po zmrazení. Jako kryoprotektivní média byly použity roztoky doporučované Kopeikou (1986) a Kurokurou (1984). Sperma bylo po naředění mrazeno v pejetách 0,5 ml v termoboxu 3, 6 a 9 cm nad povrchem tekutého dusíku po dobu 20 minut. Průběh teplot během zmrazování byl zaznamenáván uvnitř a vně pejet termočlánkovým teploměrem s miniaturními sondami typu T (měděno-konstantanové). Ve 3 cm nad povrchem tekutého dusíku, byla zaznamenána nejnižší teplota -170°C, v 6 cm -110°C a v 9 cm -70°C. Nejlepších výsledků po zmrazení a rozmrazení bylo dosaženo u roztoku Kopeika ve 3 cm nad tekutým dusíkem: 27% pohyblivých spermií, rychlost pohybu 118 ?m.s-1. Při použití roztoku Kurokura byla dosažena motilita 14% a rychlost pohybu 76 ?m.s-1. U nativního spermatu byla motilita 88% a rychlost 136 ?m.s-1.
|
host ::
RSS.