|
|
Studium metabolismu vzdušných polutantů a mutagenů 3-nitrobenzanthronu a 2-nitrobenzanthronu
Čechová, Tereza ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
Aromatické nitrosloučeniny jsou látky přítomné ve všech složkách životního prostředí. Jsou považovány za jeho toxické a karcinogenní kontaminanty. Většina nitroaromátů vykazuje v bakteriálních a savčích systémech mutagenní aktivitu. Existují karcinogeny vyvolávající nádorové procesy, především v játrech, plicích a prsních žlázách. 3-Nitrobenzanthron (3-NBA, 3-nitro-7H-benz[de]anthracen-7-on) je jednou z polycyklických aromatických nitrosloučenin s vysokými toxickými účinky. 3-NBA se vyskytuje ve složkách životního prostředí a je přítomný i ve výfukových plynech, byl také detekován v půdě a jeho výskyt byl prokázán i v dešťové vodě. 2 Nitrobenzanthron (2-NBA, 2-nitro-7H-benz[de]anthracen-7-on) je izomerem 3-NBA nalezeným jako polutant znečištěného ovzduší. I když je 2-NBA látkou slabě toxickou, jeho vysoká koncentrace v ovzduší by mohla představovat vysoké zdravotní riziko pro lidskou populaci. Diplomová práce rozšiřuje poznatky o metabolismu 3-NBA a jeho izomeru 2 NBA za anaerobních a aerobních podmínek. Ke studiu metabolismu těchto látek byly využívány jaterní mikrosomální systémy kontrolních potkanů (nepremedikovaných žádným induktorem cytochromů P450 - CYP) a potkanů premedikovaných Sudanem I, -naftoflavonem, fenobarbitalem, ethanolem a pregnenolon 16-karbonitrilem (PCN), látek, které indukují CYP 1A,...
|
|
|
Heterologní exprese lidské NADPH:cytochrom P450 reduktasy
Mazurová, Martina ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
Se studiem karcinogenese přímo souvisí studium metabolismu xenobiotik, neboť ta se mohou na vzniku rakoviny podílet. Systém monooxygenas se smíšenou funkcí, který se na odbourávání cizorodých látek významně podílí, je v laboratoři, v níž byla práce prováděna, studován především pomocí experimentů in vitro. Pro získání potřebných rekombinantních enzymů se v současnosti hojně využívá metoda heterologní exprese. V této práci byla tato metoda použita pro přípravu lidské NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasy, membránového enzymu, který redukuje cytochrom P450 a tím umožňuje jeho katalytickou aktivitu. Byly připraveny a ověřeny vektory, nesoucí syntetický gen pro lidskou NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasu, založené na plasmidech pUC19 a pET22b. Reduktasa byla produkována v buňkách E. coli BL21-Gold a E. coli BL21-CodonPlus-RIL. Celková produkce proteinu v buňkách byla vysoká, problémem však bylo, že vznikající protein byl přítomen převážně v inkluzních tělískách. Byly částečně optimalizovány podmínky exprese tak, aby zvětšil podíl nativního proteinu v bakteriální membránové frakci.
|
|
|
Heterologní exprese NADPH:cytochrom P450 reduktasy
Stráňava, Martin ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
NADPH:cytochrom P450 reduktasa (CPR) je flavoprotein o velikosti 78 kDa, který je spolu s cytochromy P450 součástí monooxygenasového systému vázaného v membráně endoplasmatického retikula. Monooxygenasový systém se účastní metabolizmu široké škály organických látek, včetně léčiv nebo různých polutantů přítomných v životním prostředí (polycyklické aromatické uhlovodíky, aromatické aminy aj.). CPR funguje jako přenašeč redukčních ekvivalentů z NADPH na příslušné cytochromy P450. Pro správnou interakci s cytochromy P450 je důležitá N-terminální hydrofobní doména kotvící protein v membráně. Odstranění této domény, např. trypsinovou proteolýzou, má za následek vznik solubilní CPR (72 kDa) a ztrátu katalytické aktivity vůči cytochromu P450. V průběhu heterologní exprese v bakteriích E. coli je proteolyticky labilní místo CPR (Lys56 - Ile57) cílem působení intracelulárních proteas s trypsinovou aktivitou, což může negativně ovlivnit výtěžky nativního 78 kDa proteinu. Předkládaná diplomová práce popisuje heterologní expresi, purifikaci a charakterizaci dvou forem potkaní CPR. Forma wtCPR představuje protein přirozeně se vyskytující v potkaním organismu (kmen Wistar), zatímco mCPR obsahuje aminokyselinovou substituci (K56Q) v místě proteolytické degradace. Výsledkem zmíněné substituce je proteolyticky...
|
|
|
Mechanismus enzymové aktivace karcinogenů a léčiv systémem cytochromů P450
Indra, Radek ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Souček, Pavel (oponent) ; Koblihová, Jitka (oponent)
12 Abstrakt Environmentální polutant benzo[a]pyren (BaP) je prokazatelným lidským karcinogenem, který se po aktivaci cytochromy P450 (CYP) kovalentně váže na DNA. V rámci dizertační práce byl studován vliv jednotlivých složek systému monooxygenas se smíšenou funkcí (MFO), systému lokalizovanému v membráně endoplasmatického retikula, na metabolismus benzo[a]pyrenu a na tvorbu aduktů BaP s DNA. Zaměřili jsme se především na porovnání vlivu cyt b5 na tento metabolismus a potenciál cyt b5 sloužit jako donor elektronů v rámci reakčního cyklu cytochromu P450 1A1. Tento vliv byl studován jednak z pohledu tvorby metabolitů BaP, a jednak z pohledu tvorby jeho aduktů s DNA. Byl také studován vliv dvou expresních systémů pro cytochrom P450 1A1 (prokaryotický a eukaryotický), na jeho účinnost v metabolismu BaP. Vliv cyt b5 na účinnost monooxygenasového systému byl studován i s další cizorodou látkou, rostlinným alkaloidem ellipticinem, jenž vykazuje protinádorové účinky. Jeho protinádorový efekt, stejně jako vedlejší účinky, závisí na jeho metabolické aktivaci cytochromy P450. Významný z tohoto hlediska je zejména CYP3A4. Ten byl proto použit i v našich experimentech. Dále byla v práci studována vhodnost laboratorního potkana sloužit jako model metabolického osudu BaP v lidském organismu. Při studiu...
|
|
|
Inhibitory tyrosinkinas jako protinádorová léčiva nové generace
Hromek, Vlastimil ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Bárta, František (oponent)
V dnešní době se při léčbě různých typů nádorových onemocnění využívá různých druhů léčby. Mezi nejčastější způsoby léčby patří operativní vyjmutí nádoru, radioterapie, chemoterapie a imunoterapie. Při chemoterapii se využívá širokého spektra chemoterapeutik, jako jsou například alkylační činidla, platinové sloučeniny, antimetabolity, antracykliny a v poslední době velmi se rozvíjející inhibitory tyrosinkinas. Tato bakalářská práce pojednává o inhibitorech tyrosinkinas a jejich využití v medicíně při léčbě nádorových onemocnění, z důvodu jejich vysoké specifity a následkem toho nízkých vedlejších účinků. Prvním průlomovým úspěchem inhibitorů tyrosinkinas byla léčba pacientů s chronickou myeloidní leukémií (CML) pomocí imatinibu. Na tento úspěch se pokouší navázat i použití vandetanibu, při léčbě medulárního karcinomu štítné žlázy. U pacientů léčených vandetanibem však dochází k biotransformaci tohoto xenobiotika cytochromy P450, které jsou terminálními oxidasami monooxygenasového (MFO - "mixed function oxidases") systému, přičemž dochází k přeměně vandetanibu na méně účinné metabolity. V praktické části bakalářské práce byly izolovány enzymy metabolizující xenobiotika, včetně vandetanibu. Z potkaních jater byly izolovány NADPH:cytochrom P450 reduktasa, kterou jsme získali jako homogenní preparát a...
|
|
|
Inhibitory tyrosinkinas jako protinádorová léčiva nové generace
Hromek, Vlastimil ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Bárta, František (oponent)
V dnešní době se při léčbě různých typů nádorových onemocnění využívá různých druhů léčby. Mezi nejčastější způsoby léčby patří operativní vyjmutí nádoru, radioterapie, chemoterapie a imunoterapie. Při chemoterapii se využívá širokého spektra chemoterapeutik, jako jsou například alkylační činidla, platinové sloučeniny, antimetabolity, antracykliny a v poslední době velmi se rozvíjející inhibitory tyrosinkinas. Tato bakalářská práce pojednává o inhibitorech tyrosinkinas a jejich využití v medicíně při léčbě nádorových onemocnění, z důvodu jejich vysoké specifity a následkem toho nízkých vedlejších účinků. Prvním průlomovým úspěchem inhibitorů tyrosinkinas byla léčba pacientů s chronickou myeloidní leukémií (CML) pomocí imatinibu. Na tento úspěch se pokouší navázat i použití vandetanibu, při léčbě medulárního karcinomu štítné žlázy. U pacientů léčených vandetanibem však dochází k biotransformaci tohoto xenobiotika cytochromy P450, které jsou terminálními oxidasami monooxygenasového (MFO - "mixed function oxidases") systému, přičemž dochází k přeměně vandetanibu na méně účinné metabolity. V praktické části bakalářské práce byly izolovány enzymy metabolizující xenobiotika, včetně vandetanibu. Z potkaních jater byly izolovány NADPH:cytochrom P450 reduktasa, kterou jsme získali jako homogenní preparát a...
|
|
|
Mechanismus enzymové aktivace karcinogenů a léčiv systémem cytochromů P450
Indra, Radek ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Souček, Pavel (oponent) ; Koblihová, Jitka (oponent)
12 Abstrakt Environmentální polutant benzo[a]pyren (BaP) je prokazatelným lidským karcinogenem, který se po aktivaci cytochromy P450 (CYP) kovalentně váže na DNA. V rámci dizertační práce byl studován vliv jednotlivých složek systému monooxygenas se smíšenou funkcí (MFO), systému lokalizovanému v membráně endoplasmatického retikula, na metabolismus benzo[a]pyrenu a na tvorbu aduktů BaP s DNA. Zaměřili jsme se především na porovnání vlivu cyt b5 na tento metabolismus a potenciál cyt b5 sloužit jako donor elektronů v rámci reakčního cyklu cytochromu P450 1A1. Tento vliv byl studován jednak z pohledu tvorby metabolitů BaP, a jednak z pohledu tvorby jeho aduktů s DNA. Byl také studován vliv dvou expresních systémů pro cytochrom P450 1A1 (prokaryotický a eukaryotický), na jeho účinnost v metabolismu BaP. Vliv cyt b5 na účinnost monooxygenasového systému byl studován i s další cizorodou látkou, rostlinným alkaloidem ellipticinem, jenž vykazuje protinádorové účinky. Jeho protinádorový efekt, stejně jako vedlejší účinky, závisí na jeho metabolické aktivaci cytochromy P450. Významný z tohoto hlediska je zejména CYP3A4. Ten byl proto použit i v našich experimentech. Dále byla v práci studována vhodnost laboratorního potkana sloužit jako model metabolického osudu BaP v lidském organismu. Při studiu...
|
|
|
Oxidace benzo(a)pyrenu cytochromem P450 1A1 exprimovaným v prokaryotickém a eukaryotickém systému
Kroftová, Natálie ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Benzo[a]pyren (BaP) je významným lidským kancerogenem. Je metabolizován řadou enzymových systémů jako jsou cytochromy P450 (CYP) a epoxidhydrolasa. Cílem předkládané diplomové práce bylo studium metabolismu BaP in vitro jaterním mikrosomálním systémem potkanů premedikovaných induktory cytochromů P450 a dále lidským cytochromem P450 1A1 (CYP1A1) exprimovaným v eukaryotickém a prokaryotickém systému. Eukaryotický expresní systém byl tvořen mikrosomy izolovanými z hmyzích buněk, zatímco prokaryotický expresní systém tvořily "zlomky" membrán E. coli. V rámci rekombinantního lidského CYP1A1 byl zkoumán vliv cytochromu b5, NADPH:cytochrom P450 reduktasy (CPR) a epoxidhydrolasy na oxidaci BaP. Izolace a purifikace králičí jaterní CPR byla dalším cílem této práce. Metabolity vzniklé oxidací BaP byly separovány metodou HPLC. Výsledky získané v diplomové práci demonstrují, že jaterní mikrosomální systémy potkanů premedikovaných induktory CYP podrodiny 1A (Sudanem I), podrodiny 2B (fenobarbitalem) a podrodiny 3A (PCN) vykazují vyšší efektivitu oxidovat BaP než mikrosomy kontrolních potkanů. BaP je oxidován lidským CYP1A1 exprimovaným v eukaryotickém systému na šest metabolitů (BaP-9,10-dihydrodiol, metabolit BaP s dosud neurčenou strukturou, BaP-7,8-dihydrodiol, BaP-1,6-dion, BaP-3,6-dion a BaP-3-ol), zatímco...
|
|
|
Studium metabolismu vzdušných polutantů a mutagenů 3-nitrobenzanthronu a 2-nitrobenzanthronu
Čechová, Tereza ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
Aromatické nitrosloučeniny jsou látky přítomné ve všech složkách životního prostředí. Jsou považovány za jeho toxické a karcinogenní kontaminanty. Většina nitroaromátů vykazuje v bakteriálních a savčích systémech mutagenní aktivitu. Existují karcinogeny vyvolávající nádorové procesy, především v játrech, plicích a prsních žlázách. 3-Nitrobenzanthron (3-NBA, 3-nitro-7H-benz[de]anthracen-7-on) je jednou z polycyklických aromatických nitrosloučenin s vysokými toxickými účinky. 3-NBA se vyskytuje ve složkách životního prostředí a je přítomný i ve výfukových plynech, byl také detekován v půdě a jeho výskyt byl prokázán i v dešťové vodě. 2 Nitrobenzanthron (2-NBA, 2-nitro-7H-benz[de]anthracen-7-on) je izomerem 3-NBA nalezeným jako polutant znečištěného ovzduší. I když je 2-NBA látkou slabě toxickou, jeho vysoká koncentrace v ovzduší by mohla představovat vysoké zdravotní riziko pro lidskou populaci. Diplomová práce rozšiřuje poznatky o metabolismu 3-NBA a jeho izomeru 2 NBA za anaerobních a aerobních podmínek. Ke studiu metabolismu těchto látek byly využívány jaterní mikrosomální systémy kontrolních potkanů (nepremedikovaných žádným induktorem cytochromů P450 - CYP) a potkanů premedikovaných Sudanem I, -naftoflavonem, fenobarbitalem, ethanolem a pregnenolon 16-karbonitrilem (PCN), látek, které indukují CYP 1A,...
|
|
|
Heterologní exprese NADPH:cytochrom P450 reduktasy
Stráňava, Martin ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
NADPH:cytochrom P450 reduktasa (CPR) je flavoprotein o velikosti 78 kDa, který je spolu s cytochromy P450 součástí monooxygenasového systému vázaného v membráně endoplasmatického retikula. Monooxygenasový systém se účastní metabolizmu široké škály organických látek, včetně léčiv nebo různých polutantů přítomných v životním prostředí (polycyklické aromatické uhlovodíky, aromatické aminy aj.). CPR funguje jako přenašeč redukčních ekvivalentů z NADPH na příslušné cytochromy P450. Pro správnou interakci s cytochromy P450 je důležitá N-terminální hydrofobní doména kotvící protein v membráně. Odstranění této domény, např. trypsinovou proteolýzou, má za následek vznik solubilní CPR (72 kDa) a ztrátu katalytické aktivity vůči cytochromu P450. V průběhu heterologní exprese v bakteriích E. coli je proteolyticky labilní místo CPR (Lys56 - Ile57) cílem působení intracelulárních proteas s trypsinovou aktivitou, což může negativně ovlivnit výtěžky nativního 78 kDa proteinu. Předkládaná diplomová práce popisuje heterologní expresi, purifikaci a charakterizaci dvou forem potkaní CPR. Forma wtCPR představuje protein přirozeně se vyskytující v potkaním organismu (kmen Wistar), zatímco mCPR obsahuje aminokyselinovou substituci (K56Q) v místě proteolytické degradace. Výsledkem zmíněné substituce je proteolyticky...
|
host ::
RSS.