|
|
Úloha variabilních řetězců na rozhraní podjednotek ve formování ATP-vazebné kapsy a funkci P2X4 receptoru
Tvrdoňová, Vendula ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent) ; Vlachová, Viktorie (oponent)
5 ABSTRAKT Krystalizace P2X4 receptoru (P2X4R) ze zebřičky ("zebra fish", zfP2X4) v uzavřeném a otevřeném stavu odhalila změny v konformacích ektodomény včetně změn v oblasti styčných ploch mezi levou ("left flipper"; LF) a hřbetní ("dorsal fin"; DF) ploutví. Roli těchto struktur ve formování ATP vazebné kapsy a funkci receptoru jsme zkoumali pomocí alaninové skenovací mutageneze úseků LF (D280-N293) a DF (R203-L214) potkaního P2X4R, a s využitím ATP a analogických agonistů 2-(methylthio)adenosin 5'- trifosfátu, adenosin 5'-(γ-thio)trifosfátu, 2'(3'-O-(4-benzoylbenzoyl)adenosin 5'- trifosfátu a α,β-methylenadenosin 5'-trifosfátu. Sníženou citlivost anebo účinnost ATP mělo 15 z 26 vytvořených mutací. Mutace R203A, N204A a N293A byly v podstatě nefunkční, ale jejich funkci bylo možné obnovit ivermektinem, alosterickým modulátorem P2X4R. Mutace I205A, T210A, L214A, P290A, G291A a Y292A měly změněnou odpověď na ATP a na analogické agonisty. Naproti tomu mutace L206A, N208A, D280A, T281A, R282A a H286A nevykazovaly ve srovnání s divokým typem receptoru žádnou změnu v odpovědích na ortosterické agonisty. Tyto pokusy, společně s homologním modelováním ukázaly, že aminokyseliny z první skupiny nacházející se v horní části obou řetězců LF a DF, se podílejí na přesné organizaci ATP-vazebné kapsy a iniciaci převodu...
|
|
|
Spontánní vápníková propustnost iontového kanálu P2X receptoru po záměně konzervovaného tyrosinu v 1 . transmembránové doméně
Rupert, Marian ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Balík, Aleš (oponent)
Purinergní P2X receptory jsou membránové iontové kanály, které jsou aktivované extracelulárním ATP. U obratlovců kóduje podjednotky P2X receptorů sedm genů. Podjednotky, označované P2X1 - 7, mají 40 - 50 % shodných aminokyselinových sekvencí. P2X receptory se skládají ze tří podjednotek a ve tkáních obratlovců se vyskytují jako homo- nebo heterotrimery. P2X receptory mají v organismu širokou distribuci, funkční receptory byly nalezeny v neuronech, gliových buňkách, svalových buňkách a také v neexcitabilních tkáních, jako jsou epitely, endotely a hemopoietické tkáně. Purinergní signalizace má významnou úlohu v přenosu bolesti, při poranění CNS a v imunitních procesech. Podjednotka P2X receptoru se skládá ze dvou transmembránových domén, extracelulární domény a intracelulárních N- a C- konců. Každá transmembránová doména obsahuje dvě aminokyseliny konzervované napříč všemi P2X podjednotkami. V první transmembránové doméně receptoru P2X2 jsou to Gly30 a Tyr43 . V předchozích experimentech bylo elektrofyziologickými měřeními prokázáno, že u receptoru P2X2 po záměně konzervovaného Tyr43 v první transmembránové doméně za alanin dochází k prodloužení doby deaktivace iontového kanálu po odmytí agonisty. Tato práce je zaměřena na objasnění role konzervovaného tyrozinu v procesu otvírání a zavírání iontového...
|
|
|
Funkční úloha cytoplazmatických konců ankyrinového receptoru TRPA1
Vašková, Jana ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Zemková, Hana (oponent)
Receptor TRPA1 je převážně exprimován na primárních aferentních senzorických neuronech, kde může být aktivován širokým spektrem štiplavých a reaktivních sloučenin, jakými jsou například allyl isothiokyanát nebo cinnamaldehyd. Tyto látky aktivují TRPA1 prostřednictvím kovalentní modifikace cysteinů z cytoplazmatické strany, odkud může být kanál zároveň modulován vnitrobuněčnými vápenatými ionty. Významnou roli v těchto procesech hrají aminové (N-) a karboxylové (C-) konce receptoru. Předkládaná diplomová práce přináší nové poznatky o úloze specifických cytoplazmatických domén v aktivaci TRPA1 receptoru, jež byla studována pomocí elektrofyziologických a molekulárně biologických metod. Měřením membránových proudů TRPA1, vyvolaných chemicky, napětím a vápenatými ionty, byla nalezena vysoce konzervovaná serinová a threoninová rezidua v rámci N-koncové ankyrinové domény, jejichž mutacemi byly silně ovlivněny odpovědi kanálu. Zároveň bylo nově zjištěno, že distální karboxylový konec, o němž bylo již dříve známo, že se podílí na regulaci receptoru vápenatými ionty, přispívá k napěťově závislé aktivaci TRPA1 receptoru.
|
|
|
Modulační mechanizmy nociceptivních TRP kanálů
Maršáková, Lenka ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent) ; Zemková, Hana (oponent)
Detekce bolestivých podnětů na periferii a jejich transdukce do CNS je zprostředkována některými zástupci teplotně citlivých transient receptor potential (TRP) kanálů, kteří se exprimují na volných zakončeních primárních aferentních senzorických neuronů nazývaných nociceptory. Prostřednictvím TRP kanálů nociceptory vnímají nejen teplotní stimuly, ale také podněty mechanické a chemické. Ze sedmi v současnosti identifikovaných teplotně citlivých TRP kanálů jsou za detekci bolestivých teplotních podnětů zodpovědní dva teplem aktivovaní zástupci vaniloidních receptorů: TRPV1 (≥ 42 řC), TRPV2 (≥ 52 řC) a jeden chladem aktivovaný zástupce ankyrinových receptorů TRPA1 (≤ 17 řC). Tyto kanály jsou typické složitým a dosud neznámým mechanizmem působení, jejichž poznání je nezbytné k pochopení jejich komplexních funkcí v organizmu a následně pro navrhování potenciálních analgetik. Nové poznatky, které jsou náplní této studie, směřují k objasnění mechanizmů působení dvou výše zmíněných nociceptivních receptorů TRPV1 a TRPA1, se zaměřením na kafrovou a napěťovou citlivost TRPV1 a vápníkovou modulaci TRPA1 receptoru. Prvním tématem, které je v této práci diskutováno, je modulační mechanizmus kafru na TRPV1 receptor. Kafr je účinnou, v přírodě se vyskytující látkou používanou díky svým analgetickým účinkům od nepaměti....
|
|
|
Struktura a funkce rekombinantního P2X4 receptoru
Rokič, Miloš ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Vlachová, Viktorie (oponent) ; Bendová, Zdeňka (oponent)
5 Abstrakt Purinergní P2X receptory jsou membránové iontové kanály aktivované extracelulárním ATP. U savců bylo dosud nalezeno sedm různých podtypů, označovaných jako P2X1-7, které svojí stavbou představují rodinu ligandem řízených iontových kanálů s výjimečnými strukturně/funkčními vlastnostmi. Každý P2X receptor je tvořen třemi podjednotkami, kde každá podjednotka má dvě transmembránové domény. Krystalografická data ukazují, že pór iontového kanálu se nachází mezi druhými transmembránovými doménami. Krystalová struktura P2X4 receptoru zebřičky (Danio rerio) je dostupná pro receptor v uzavřeném a otevřeném stavu s navázanou molekulou ATP, a proto je přesná struktura vazebného místa pro ATP vyřešena. Cílem této dizertační práce bylo studium strukturně-funkčních vlastností v modelu rekombinantního P2X4 receptoru. Technikou bodové mutageneze a elektrofyziologickou technikou patch clamp byl zkoumán funkční význam pěti konzervovaných cysteinových párů v ektodoméně a funkční úloha aminokyselinových zbytků, které tvoří extracelulární vestibul P2X4 iontového kanálu potkana. Všech deset cysteinů, jeden po druhém, bylo nahrazeno alaniny nebo threoniny a ATP-stimulované proudy byly snímány z HEK293T buněk nesoucích divoký typ P2X4 receptoru nebo jeho mutace. Výsledky získané u mutací C116A, C126A, C149A a C165A...
|
|
|
Mechanizmy aktivace a modulace vaniloidních TRP receptorů
Boukalová, Štěpána ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Hock, Miroslav (oponent) ; Zemková, Hana (oponent)
Štěpána Boukalová Mechanizmy aktivace a modulace vaniloidních TRP receptorů TRPV1 a TRPV3 receptory jsou teplocitlivé iontové kanály patřící do rodiny vaniloidních TRP receptorů. TRPV1 receptor, jenž je specificky exprimován v nociceptivních neuronech, představuje klíčovou molekulu v transdukční dráze bolestivých podnětů, včetně nociceptivního tepla. Význam TRPV3 receptorů ve vnímání tepelných podnětů je prozatím sporný, dobře prokázaná je však jeho úloha v regulaci proliferace a diferenciace keratinocytů. TRP receptory, podobně jako napěťově ovládané draslíkové kanály (Kv), jsou tvořeny čtyřmi podjednotkami, jež každá obsahuje šest transmembránových segmentů (S1-S6). V první části své dizertační práce jsem se zaměřila na úlohu S1 transmembránové oblasti ve funkčních vlastnostech TRPV1 receptoru. Z našich výsledků vyplývá, že část S1 směřující do extracelulárního prostředí hraje významnou úlohu ve vrátkování iontového kanálu. Konzervativní mutace kladně nabitého rezidua v dané oblasti (R455K mutace) vedla ke vzniku TRPV1 iontových kanálů se zvýšenou aktivitou, jež však nebyly citlivé ke stimulačnímu působení sníženého pH prostředí. Naopak, zvýšená koncentrace protonů v extracelulárním prostředí vedla ke stabilizaci zavřeného stavu mutantního iontového kanálu. Velmi podobné fenotypické vlastnosti jako u...
|
|
|
Exprese podjednotek AMPA glutamátových receptorů v suprachiasmatickém jádře potkana
Červená, Kateřina ; Bendová, Zdeňka (vedoucí práce) ; Zemková, Hana (oponent)
Hlavní cirkadiánní pacemaker savců uložený v suprachiasmatických jádrech hypotalamu (SCN), je adaptován ke změnám ve vnějším prostředí synchronizací své endogenní periody střídáním světla a tmy během dne a noci. Informace o světle putuje glutamátergním retinohypotalamickým traktem do ventrolaterální části SCN. Aktivace ionotropních glutamátových receptorů v této oblasti prokazatelně zprostředkovává přenos informace o světle na transkripční aparát světloreaktivních buněk. Hojně prozkoumané jsou receptory typu NMDA, jejichž některé podjednotky vykazují v SCN cirkadiánní rytmus a zvýšenou expresi po světelném pulzu. AMPA signalizace v SCN je daleko méně prozkoumaná. Cílem této práce bylo určit, které podjednotky AMPA receptorů jsou exprimovány v SCN potkana, zda tyto podjednotky vykazují denní rytmus a reaktivitu na světelný pulz a nastínit, jaké různé úlohy mohou jednotlivé receptory typu AMPA v SCN plnit. Klíčová slova: cirkadiánní rytmy, suprachiasmatická jádra, glutamátové receptory, AMPA
|
|
|
Studium farmakologie a funkce vazebných míst nikotinových acetylcholinových receptorů
Kaniaková, Martina ; Krůšek, Jan (vedoucí práce) ; Chaloupka, Roman (oponent) ; Zemková, Hana (oponent)
Název práce: Studium farmakologie a funkce vazebných míst nikotinových acetylcholinových receptorů Autor: Mgr. Martina Kaniaková Katedra / Ústav: Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. Vedoucí disertační práce: RNDr. Jan Krůšek, CSc., Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. Abstrakt: Nikotinové acetylcholinové receptory (nAChR) jsou ligandem otevírané iontové kanály. Jejich funkční vlastnosti a možnosti farmakologického ovlivnění jsme studovali prostřednictvím techniky terčíkového zámku (patch-clamp) v konfiguraci měření proudu z celé buňky. Zkoumali jsme vlastnosti neuronálních receptorů heterologně exprimovaných v linii COS buněk a svalových receptorů přirozeně exprimovaných buněčnou linií TE671. Lobelin, rostlinný alkaloid s dlouholetou historií terapeutického využití, je schopen přímé interakce s nikotinovými acetylcholinovými receptory ve vazebném místě pro agonistu. Zjistili jsme, že výsledný účinek této interakce je závislý na aplikované koncentraci lobelinu, přítomnosti dalšího agonisty, časovém schématu aplikace a v neposlední řadě na podtypu receptoru. Souhrnně lze lobelin označit za velmi slabého parciálního agonistu nAChR s výraznou schopností desensitizovat některé podtypy receptorů. V kombinaci s jinými agonisty lobelin účinkuje buď jako kompetitivní antagonista nebo koagonista. Pomocí bodových mutací jsme...
|
|
|
Vliv první transmembránové domény na kinetiku desenzitizace P2X4 receptoru.
Kalasová, Ilona ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Extracelulární adenosin-5'-trifosfát (ATP) je důležitou signální molekulou. Buňky prakticky všech tkání eukaryotických organismů řízeně uvolňují ATP a exprimují i odpovídající purinergní receptory. Ionotropní P2X receptory jsou trimerní iontové kanály propustné pro K+, Na+ a Ca2+ kationty. Jedna podjednotka P2X receptoru se skládá ze dvou transmembránových domén (TM1 a TM2), velké extracelulární smyčky a intracelulárních konců. Transmembránová část receptoru je tak tvořena šesti helikálními doménami. Podle krystalové struktury zfP2X4 receptoru jsou TM1 helixy orientovány periferně a stabilizují TM2 helixy tvořící zátku póru. Elektrofyziologické studie ale naznačují, že se TM1 může podílet i na otevírání a zavírání receptoru a tvorbě iontového póru. V této práci byla zkoumána úloha TM1 v procesu desenzitizace potkaního P2X4 receptoru metodou cysteinové skenovací mutageneze. Byla identifikována dvě rezidua TM1 (Asn32 a Tyr42), jejichž mutace prodlužují dobu desenzitizace P2X4 receptoru. Pokusy s parciálním agonistou α,β-methylenadenosin-5'-trifosfátem (αβ-meATP) prokázaly, že změna konformace TM domén v procesu desenzitizace je nezávislá na konformačních změnách způsobených navázáním agonisty. Konzervovaný Tyr42 se nachází v blízkosti TM2 sousední podjednotky, pravděpodobně interaguje s Met336 a ovlivňuje tak...
|
|
|
Funkční úloha P2X receptorů v supraoptických jádrech hypotalamu potkana a strukturně-funkční vlastnosti rekombinantních P2X receptorů.
Vávra, Vojtěch ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Novák, František (oponent) ; Vyklický, Ladislav (oponent)
Purinergní P2X receptory jsou membránové kationtové kanály stimulované extracelulárním ATP. U savců bylo dosud nalezeno sedm různých podtypů, označovaných jako P2X1-7, které svojí stavbou představují novou rodinu ligandem řízených iontových kanálů s výjimečnými strukturně-funkčními vlastnostmi. Tyto receptory jsou součástí rozsáhlého purinergního signalizačního komplexu, který se uplatňuje jak v nervovém systému tak v somatických tkáních. V centrálním nervovém systému jsou P2X receptory velmi hojně zastoupeny v hypotalamu a hypofýze, kde se podílí na řízení základních homeostatatických a reprodukčních funkcí organismu. Hlavní část mé práce pojednává o expresi a funkční úloze neuronálních P2X receptorů v supraoptických jádrech hypotalamu v mozku potkana. V magnocelulárních supraoptických neuronech jsou syntetizovány hormony oxytocin a arginin-vasopresin, které regulují porod a laktaci, respektive hospodaření organismu s vodou a udržování krevního tlaku. Výlev obou hormonů do systémového oběhu ze zadního laloku hypofýzy závisí na elektrické aktivitě supraoptických neuronů, která je řízena synaptickými vstupy aferentních neuronů. V nedávné době bylo nalezeno, že sekrece hormonu je stimulována také extracelulárním ATP. Cílem mé práce bylo zjistit podtypy přítomných P2X receptorů a jejich význam pro...
|
host ::
RSS.