|
| |
|
| |
|
| |
|
|
Studium role konformace N-konce řetězce B insulinu ve vazbě na insulinový receptor
Kosinová, Lucie ; Žáková, Lenka (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Insulin je významný peptidový hormon slinivky břišní. Jeho základní funkcí v organismu je regulace vstupu molekul glukosy do buněk, čímž ovlivňuje metabolismus sacharidů a následně i proteinů a lipidů. Nedostatek insulinu, ať už částečný nebo úplný, vyvolává komplexní onemocnění diabetes mellitus. Podle Mezinárodní diabetologické federace (IDF) žilo v roce 2012 na naší planetě 371 milionů lidí ve věku 20-79 let trpících touto chorobou. Diabetes se tak stává celosvětovým zdravotně sociálním problémem a důležitost jeho výzkumu stále roste. Při interakci insulinu s insulinovým receptorem dochází v molekule insulinu ke konformačním změnám, ke kterým patří i přechod N-konce řetězce B insulinu mezi stavem T a R. Význam těchto dvou konformací nebyl doposud objasněn a zůstává předmětem intenzivního výzkumu. V této práci bylo celkovou chemickou syntézou připraveno celkem pět nových insulinových analogů - AibB3-insulin, AibB5-insulin, AibB8-insulin, D-ProB8- insulin a N-MeAlaB8-insulin. Všechny analogy byly připraveny za účelem získání informací, které by mohly přispět k objasnění významu konformací T a R insulinu a jejich úlohy při interakci insulinu s insulinovým receptorem. Kyselina α-aminoisomáselná byla použita z důvodu její výjimečné schopnosti silně indukovat šroubovicovou strukturu v peptidovém...
|
|
|
Syntéza a charakterizace nových analogů insulinu s cílem objasnit interakci insulinu s jeho receptorem
Kletvíková, Emília ; Jiráček, Jiří (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Hrabal, Richard (oponent)
Tato disertační práce je zaměřena na studium insulinových analogů modifikovaných na C-konci B-řetězce s cílem sledovat vliv vložené mutace na dimerizaci insulinu a interakci s insulinovým receptorem (IR). Připraveny byly analogy s modifikacemi v pozicích B24-B26, kde byly do peptidového řetězce syntetickými a semisyntetickými metodami vloženy kódované i nekódované aminokyseliny. Studovány byly jak analogy plné délky, tak analogy zkrácené o tři až čtyři C- koncové aminokyseliny. Metodou kompetice analogu s radioaktivním (125I) lidským insulinem byla určena vazebná afinita k receptoru. Metodou isotermální titrační mikrokalorimetrie byla určena dimerizační schopnost analogů, a to zejména analogů s N- methylovanou peptidovou vazbou v pozicích B23-B24, B24-B25 a B25-B26. Metodou rentgenové krystalografie a metodou nukleární magnetické resonance byly určeny struktury vybraných analogů. Tyto struktury byly konfrontovány s vazebnou afinitou analogů s cílem charakterizovat aktivní konformaci insulinu. Charakterizovány byly analogy vykazující jak vyšší, tak i ekvipotentní či nižší vazební afinitu k IR. Výsledky krystalových struktur ukazují, že pro vazbu na receptor je důležité zachování určitého stupně ...
|
|
|
Studium molekulárních mechanismů funkce 14-3-3 proteinů
Šilhán, Jan ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Závěr Hlavním cílem této doktorské práce bylo objasnění molekulárních mechanismů funkce 14-3-3 proteinů a vlivu na proteiny FOXO4 a tyrosinhydroxylasu. V první časti této práce (publikace I) byla potvrzena předložená hypotéza polohy Cterminálního konce molekuly 14-3-3. Bylo ukázáno, že v nepřítomnosti ligandu se Cterminální konec nachází ve vazebném místě a brání tak vstupu ligandů. Po vazbě fosforylovaných ligandů, dochází k velmi silné vazbě a vytěsnění C-terminálního konce 14-3- 3 proteinu z vazebného místa. Tyto výsledky jsou v souladu s původními pracemi, které navrhly důležitost tohoto segmentu jako inhibitoru nepatřičných ligandů. Druhá část této doktorské práce poskytuje rozsáhlý popis vlivu 14-3-3 proteinů na transkripční faktory FOXO4. S použitím stacionární a časově-rozlišené fluorescence byla studována interakce 14-3-3 proteinu s fosforylovaným transkripčním faktorem FOXO4. Navázání 14-3-3 proteinu způsobuje rozpad komplexu FOXO4:DNA. Tato část práce charakterizuje interakci 14-3-3 proteinu s DNA-vazebnou doménou FOXO4. Výsledky neprokázaly výrazné konformační změny v rámci DNA-vazebné domény. Spíše dochází ke sterickému bránění vazby DNA (publikace II). Ve třetí části se práce zabývá studiem interakcí 14-3-3 s fosforylovaným ligandem odvozeným od C-konce enzymu serotonin N-acetyltransferasa...
|
|
|
Studium interakce C-konce DNA-vazebné domény FOXO4 s DNA
Zusková, Iva ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent)
Forkhead transkripční faktory jsou strukturně příbuzné molekuly obsahující přibližně 110 aminokyselin-velkou konzervovanou DNA-vazebnou doménu známou jako forkhead doména. Protein FOXO4 náleží do podskupiny "O" forkhead transkripčních faktorů. Zástupci podskupiny FOXO forkhead transkripčních faktorů se podílejí na mnoha důležitých biologických procesech. FOXO faktory se účastní kontroly metabolismu, buněčného cyklu, apoptózy a ochrany vůči oxidativnímu stresu. DNA-vazebná doména členů FOXO se skládá ze tří α-helixů (H1, H2 a H3), tří β-vláken (S1, S2 a S3) a dvou flexibilních ohybů (nazývaných jako křídla W1 a W2). Úloha ohybu W2 při vazbě FOXO na DNA je nejasná. Ohyb W2 pravděpodobně interaguje s oblastí DNA předcházející hlavní vazebný motiv FOXO faktorů. Spekuluje se, že vazebná afinita DNA-vazebné domény FOXO4 k DNA roste s obsahem A-T párů v oblasti DNA předcházející hlavní vazebný motiv. Pro ověření této hypotézy byla exprimována a purifikována DNA-vazebná doména FOXO4 a byla určena její vazebná afinita ke třem různým DNA duplexům lišících se obsahem A-T párů v oblasti před hlavní vazebnou sekvencí. Vazebná afinita byla určena pomocí měření změn stacionární anisotropie fluorescence. Toto stanovení neukázalo žádné signifikantní rozdíly mezi vazebnou afinitou DNA-vazebné domény FOXO4 k DNA o...
|
|
| |
|
|
Studium struktury a interakcí vybraných forkhead transkripčních faktorů
Kohoutová, Klára ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent)
Tato magisterská práce vznikla jako součást projektu, jehož cílem je vývoj a studium nízkomolekulárních látek schopných inhibovat aktivitu transkripčního faktoru FOXO3. FOXO3 tvoří spolu s FOXO1, FOXO4 a FOXO6 FOXO podrodinu forkhead rodiny transkripčních faktorů. FOXO transkripční faktory jsou evolučně konzervované proteiny, které se účastní regulace celé řady buněčných dějů, mezi něž spadá regulace apoptózy, buněčného cyklu a metabolismu. Díky své proapototické funkci a schopnosti blokovat buněčný cyklus jsou FOXO proteiny považovány za tumorové supresory. Nicméně se ukazuje, že jejich zvýšená aktivita souvisí s mnoha typy rakovinného bujení. FOXO proteiny působí jako regulátory buněčné homeostáze, zvyšují odolnost nádorů vůči chemoterapii a podporují jejich růst. Cílem tohoto projektu je vyvinout specifické inhibitory schopné vázat se na DNA-vazebnou doménu, zkráceně DBD (z angl. DNA-binding domain, residua 156-269), FOXO3 a znemožnit tak její vazbu na DNA. Vývoj specifických inhibitorů FOXO3 vyžaduje znalost struktury DBD všech FOXO proteinů a detailní znalost jejich interakce s DNA. Doposud jsou známy struktury komplexů DNA s DBD FOXO1, FOXO3, FOXO4 a struktury volných DBD FOXO3 a FOXO4. V této práci byla vyřešena struktura volné DBD FOXO1. V předchozí práci byla studována sloučenina S9, která...
|
|
|
Biofyzikální charakterizace N-koncové části proteinkinasy ASK1.
Honzejková, Karolína ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Proteinkinasa ASK1 (z anglického "apoptosis signal-regulating kinase 1") je apikální kinasa mitogeny aktivované proteinkinasové kaskády (tzv. MAPK kaskády). Její aktivita je spouštěna např. reaktivními formami kyslíku, cytokiny, stresem endoplasmatického retikula či osmotickým stresem. Aktivace ASK1 má za následek spuštění metabolických drah, na jejichž počátcích stojí mitogeny aktivované proteinkinasy (MAPK) p38 a c-Jun N-koncová kinasa (JNK). Aktivace těchto kinas vede k zánětu nebo smrti buňky. Dysregulace ASK1 je asociována s rozvojem patologických stavů, jakými jsou neurodegenerativní, kardiovaskulární či nádorová onemocnění, což z tohoto proteinu činí potenciální cíl terapeutických zásahů. Aktivita proteinkinasy ASK1 je regulována prostřednictvím protein-proteinových interakcí, mezi hlavní negativní regulátory ASK1 řadíme rodinu dimerních proteinů 14-3-3 a redoxní protein thioredoxin 1. Příkladem pozitivních regulátorů jsou faktory asociované s TNF receptorem. Kromě toho je aktivita ASK1 přísně regulována prostřednictvím oligomerizace. Navzdory neustálému pokroku, kterého je dosahováno v rámci studia tohoto proteinu, je přesný molekulární mechanismus regulace ASK1 a vliv oligomerizace na tento proces nejasný, částečně z důvodu nedostatku strukturních dat. Interakce N-koncových částí dvou...
|
host ::
RSS.