|
|
Studium exprese MDR pump u kvasinek Saccharomyces cerevisiae za různých růstových podmínek: metoda s fluorescenční sondou diS-C3(3)
Zahumenský, Jakub ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
V tejto práci sme študovali dva kvasinkové transportéry z rodiny ABC, Pdr10p a Pdr15p. V čase zadania diplomovej práce sa verilo, že tieto proteíny prispievajú ku kvasinkovému MDR fenotypu (PDR) na základe ich vysokej homológie s iným kvasinkovým MDR proteínom, Pdr5p. Aby sme tieto pumpy mohli študovať, boli pripravené dve izogénne skupiny mutantných kmeňov s deletovanými génmi kódujúcimi tieto proteíny, vo všetkých možných kombináciách delécií. Ukázalo sa, že oba tieto proteíny sú veľmi dôležité pri udržiavaní normálneho mikrookolia plazmatickej membrány pre najhojnejší, a esenciálny, kvasinkový membránový proteín, H+ -ATPázu, a tak ovplyvňujú membránový potenciál. Proteíny Pdr10p a Pdr15p tak hrajú doposiaľ neznámu úlohu pri regulácii tohoto enzýmu. Ďalej sa ukázalo, že delécia génov kódujúcich tieto proteíny výrazne znižuje možnosť aktivácie H+ -ATPázy protonofórom CCCP, ktorý je slabou kyselinou. Štúdie s imunosupresantom FK506 ďalej ukazujú, že táto látka znižuje životaschopnosť mutantného kmeňa S. cerevisiae PLY643, ktorý má deletované gény kódujúce Pdr5p, Snq2p a Yor1p. Ďalšie delécie Pdr10p a Pdr15p nezvyšujú letalitu tejto látky. Ani FK506 ani CCCP nie sú substrátmi študovaných púmp. 1
|
|
|
Studium činnosti mikrobiálních MDR-pump pomocí fluorescenčních sond: stanovení účinku potenciálních inhibitorů
Kodedová, Marie ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Höfer, Milan (oponent) ; Sychrová, Hana (oponent)
Nadměrné používání antimykotik v posledních letech vedlo ke vzniku rezistence vůči těmto látkám. Tudíž je zapotřebí vývoj nových antimykotik s různými mechanismy účinku, které by překonaly mnohačetnou lékovou rezistenci (MDR). Výhodou povrchově aktivních látek je jejich nízká toxicita pro hostitele a malá pravděpodobnost vzniku lékové rezistence. V disertační práci jsme vyvinuli metodu využívající potenciometrickou fluorescenční sondu diS-C3(3), substrát dvou hlavních MDR pump S. cerevisiae, Pdr5p a Snq2p. Pomocí této vysoce citlivé fluorescenční metody můžeme v reálném čase sledovat změny jak v aktivitě obou pump, tak v membránovém potenciálu. Díky ní můžeme efektivně vyhledávat inhibitory MDR pump s minimálními vedlejšími účinky na integritu plazmatické membrány a porovnávat efektivitu různých inhibitorů. Nové účinné inhibitory MDR pump by mohly být používány společně s antimykotiky, jež jsou substráty MDR pump. Metoda může být využita také ke stanovení mechanismu účinku povrchově aktivních látek a jejich nejnižších účinných koncentrací.
|
|
|
Nanofibrous scaffolds in controlled delivery of autologous growth factors
Buzgo, Matej ; Amler, Evžen (vedoucí práce) ; Gášková, Dana (oponent)
Preparáty z trombocytov sú zdrojom širkokého spektra autológnych rastových faktorov využite ných v tkanivovom inžinierstve. Cie om práce bolo vytvorenie nanovlákenného nosiča v kombinácii s preparátmi z trombocytov. Podarilo sa nám vytvori systém s frakciami trombocytov adhererovanými na nanovlákenný nosič. Systém stimuloval proliferáciu chondrocytov v podmienkach in vitro. Nevýhodou nosiča bolo rýchle počiatočné uvo nenie obsahu a následný pokles koncentrácie rastových faktorov spôsobujúcich krátkodobý pozitívny efekt. Pred ženie účinku bolo dosiahnuté inkorporáciou trombocytárnych preparátov do jadra koaxiálnych vláken. Pre tieto účely sme vytvorili nový derivát trombocytov - alfa granule. Nosič stimuloval proliferáciu chondrocytov a napomáhal udržiava stabilnú hladinu TGF- 1 po dobu 7 dní. Popri tom sa nám podarilo vytvori nový systém riadeného dodávania látok založený na inkorporácii intaktných lipozómov do koaxiálnych nanovláken. Porovnanie koaxiálneho systému s lipozómami, so systémami na báze koaxiálneho zvlák ovania bez lipozómov a zvlák ovania z blendu preukázalo zachovanie aktivity HRP v dvojnásobnej miere voči konkurenčným systémom. Výsledky pokusov jasne poukazujú na ve ký aplikačný potenciál nanovlákenných systémov s trombocytárnymi preparátmi a systémov s inkorporovanými lipozómami. K...
|
|
| |
|
| |
|
|
Studium činnosti kvasinkových MDR pump pomocí fluorescenčních sond: účinek potenciálních inhibitorů
Drietomská, Andrea ; Gášková, Dana (vedoucí práce)
Použitím sady piatich izogénnych mutantných kmeňov sme skúmali vplyv sady dvanástich aminoesterov mastných kyselín, patriacich medzi lyzozomotropné fungicidy (LF), na membránový potenciál a aktivitu MDR púmp Pdr5p, Snq2p a Yor1p v bunkách S. cerevisiae pomocou nedávno vyvinutej metódy, ktorá je kombináciou metódy využívajúcej fluorescenčnú sondu diS-C3(3) a biologických testov [1]. V závislosti na chemickej štruktúre a koncentrácii vykazujú LF tieto účinky na bunky: (a) depolarizáciu membrány, (b) interakciu s MDR pumpami a (c) poškodenie membrány vedúce k permeabilizácii buniek. Depolarizácia membrány bola pozorovaná takmer u všetkých LF, zatiaľ čo len tri z testovaných látok interagovali s MDR pumpami, konkrétne šlo o čiastočnú kompetitívnu inhibíciu MDR pumpy(púmp). Zistilo sa, že pomocou vyvíjanej fluorescenčnej diagnostickej metódy možno vylúčiť z kategórie potenciálnych inhibítorov tie látky, ktoré, i keď sú substrátmi púmp Pdr5p a Snq2p, nespĺňajú potrebné kritérium, že už vo veľmi nízkych koncentráciách musia zabrániť transportu sondy z buniek týmito pumpami.
|
|
| |
|
| |
|
|
Měření membránového potenciálu u mutantních kmenů Saccharomyces cerevisiae deficientních v různých membránových transportérech
Džamba, Dávid ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Potassium transport across the cell membrane is supposed to contribute to the maintenance of membrane potential. In this work, the diS-C3(3) assay was used to determine the contribution of three main potassium transporters of S. cerevisiae cells (Trk1p, Trk2p and Tok1p) to the membrane potential changes in three different growth phases. It was shown that deletions of these transporters cause hyperpolarisation of the cell membrane in exponential and early diauxic growth phases; no difference was detected in post-diauxic cells. Another contribution of this work is in a deeper study of the activity of ABC pumps which are crucial in multidrug resistance. It was proved that apart from Pdr5p and Snq2p pumps, there are also other active extrusion pumps (most likely Pdr10p and Pdr15p). It was also showed that pdr1, pdr3 mutant strain is not an equivalent of strain lacking the multidrug pumps Pdr5p, Snq2p and Yor1p. The results in this work indicate that dis-C3(3) probe is probably a substrate of other pumps such as Pdr15p. Study of these transporters with our method is thus very suitable and could provide detailed information about their kinetics and help in finding their inhibitors.
|
|
| |
host ::
RSS.