|
|
Mapping the contact points between eukaryotic translation initiation factor eIF3 and the 40S ribosomal subunit.
Kouba, Tomáš ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent) ; Staněk, David (oponent)
Iniciace translace je u eukaryot vícestupňový proces vyžadující řízenou interakci několika eukaryotických iniciačních faktorů (eIF) spolu s malou ribozomální podjednotku tak, aby se správně vyhledal začátek translace mRNA a aby se správně dekódovala genetická informace, jež nese. Největší z těchto faktorů, eIF3, podporuje jiné iniciační faktory, aby se prostorově a koordinovaně umístili na povrchu ribozomu. Naší dlouhodobou snahou je zmapovat vazebné místo kvasinkového mnohapodjednotkového eIF3 na 40S ribozomu a zde uvádíme tři nové vzájemné interakce mezi těmito dvěma makoromolekulami (i) C-terminální oblast eIF3c/NIP1 podjednotky se skládá z konzervované PCI domény a my zde ukazujeme, že krátké zkrácení na C-konci tohoto proteinu nebo jeho dvě mutace v PCI doméně způsobují fenotyp pomalého růstu nebo jsou letální a výrazně snižují množství 40S-vázaného eIF3 in vivo. Krajní C-koncová část eIF3c/NIP1 přímo interaguje s ribozomálním proteinem malé podjednotky RACK1/ASC1, který je součástí hlavy malé podjednotky, a konzistentně, delece ASC1 zhoršuje vazbu eIF3 na ribozom. Doména PCI jako taková interaguje nespecificky s RNA, zde poprvé ukázaná, jakožto schopna interakce protein-RNA. Došli jsme k závěru, že c/NIP1 C-terminální oblast tvoří důležitý mezimolekulární most mezi eIF3 a 40S hlavou ribozomu...
|
|
|
Vliv modifikací rRNA na iniciaci translace u eukaryot
Kročová, Eliška ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Kouba, Tomáš (oponent)
Modifikace ribosomální RNA se vyskytují u všech živých organismů. Funkce modifikací rRNA mohla začít být studována až ve chvíli, kdy byl popsán způsob vzniku těchto modifikací. V současné době se vědci zaměřují nejen na studium jednotlivých modifikací, ale i na význam celkové úrovně modifikací rRNA pro zrání a funkci ribosomu. Tato práce se zabývá vlivem 2'-O-methylací na cytidinu 1639 a adenosinu 100 v 18S rRNA a uridinu 2729 ve 25S rRNA na iniciaci translace u kvasinky Saccharomyces cerevisiae se zvláštním zřetelem na iniciaci translace řízené vnitřním vazebným místem pro ribosom (IRES). V průběhu diplomové práce byly úspěšně vytvořeny kmeny s delecí v genech snR51, snR70 a s dvojitou delecí v obou zmíněných genech. Byly provedeny pilotní experimenty, které ukázaly na význam produktů obou genů v iniciaci translace.
|
|
|
Příprava kvasinkového systému pro studium lidské iniciace translace
Holásková, Lucie ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Cuchalová, Lucie (oponent)
Iniciace translace je vysoce regulovaný proces. Významnou roli v něm hraje komplex eIF4F, který se skládá z 3 podjednotek - eIF4A, eIF4E a eIF4G. Protein eIF4E se váže na 7-methylguanozinovou čepičku na 5' konci mRNA, helikáza eIF4A rozvolňuje sekundární struktury na mRNA a kostru tvoří protein eIF4G. Spolupráce s dalšími iniciačními faktory je důležitá pro zahájení tvorby proteinů. Cílem mé práce bylo přispět k vytvoření kvasinkového kmene Saccharomyces cerevisiae s humanizovaným eIF4F faktorem. Nejprve jsem nahradila protein eIF4E kvasinky Saccharomyces cerevisiae za lidský protein eIF4E. S využitím delečních kazet a cre/loxP rekombinace jsem připravila kmeny s delecemi v genech eIF4GI (huΔ4G1) a eIF4GII (huΔ4G2). Charakterizace nově získaných kmenů překvapivě ukázala, že lidský eIF4E protein nahrazuje odpovídající kvasinkový orthologní faktor lépe než eIF4E z evolučně výrazně bližší Candida albicans. Pilotní pokusy s nově získanými kmeny a s kmeny závislými na eIF4E z Candida albicans též ukázaly na možný význam kvasinkového eIF4GII pro růst buněk během teplotního a osmotického stresu. Klíčová slova: iniciace translace, eIF4E, eIF4G, Saccharomyces cerevisiae
|
|
|
The role of the N-terminal domain of the a/TIF32 subunit of eIF3 in mRNA recruitment to the 43S pre-initiation complexes.
Vlčková, Vladislava ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Mašek, Tomáš (oponent)
Iniciace translace představuje složitý proces, který zajišťuje sestavení 80S ribosomu schopného elongace ze 40S a 60S ribosomálních podjednotek, z iniciátorové tRNA a z dané mRNA, a jehož správný průběh je řízen mnoha eukaryotickými iniciačními faktory (eIFs). Ačkoli je iniciace translace jedním z nejregulovanějších procesů genové exprese, přesný mechanismus jednoho z jejích klíčových kroků - nasedání mRNA na 43S preiniciační komplex (43S PIC) - stále není zcela jasný. Nejnovější studie naznačují, že kromě eIF4F a poly(A) vazebného proteinu by mohl v tomto kroku hrát důležitou úlohu taktéž iniciační faktor eIF3. V naší laboratoři byla nedávno identifikována 10-ti alaninová substituce (tzv. Box37) v a/TIF32 podjednotce faktoru eIF3 kvasinky Saccharomyces cerevisiae, specificky ovlivňující iniciaci translace. Podrobná analýza ukázala, že jediným efektem této mutace na iniciaci translace je podstatné snížení množství modelové mRNA ve 48S preiniciačních komplexech izolovaných z frakcí gradientu. Nedávno objevená struktura N terminální části a/TIF32 navíc odhalila dva aminokyselinové zbytky v oblasti Boxu37 - Arg363 a Lys364 - tvořící kladně nabitou oblast na povrchu proteinu a/TIF32 potenciálně schopnou vazby mRNA. Substituce těchto aminokyselin na alaniny taktéž narušila krok nasedání mRNA na 43S PIC in vivo,...
|
|
|
Dissection of eIF3 functional domains promoting the 48S pre-initiation complex assembly
Beznosková, Petra ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Novotný, Marian (oponent)
V eukaryotech, iniciace translace je řízena až dvanácti iniciačními faktory (eIF) a začíná zformováním 43S pre-iniciačního komplexu (PIC), který se skládá z malé ribozomální podjednotky (40S), eIF2.GTP/Met-tRNAi Met ternárního komplexu a eIF1,1A 3 a 5. 43S PIC interaguje s 5' koncem mRNA (navázání mRNA), čímž tvoří 48S PIC, který cestuje po mRNA ve směru 5'-3' a hledá AUG počáteční kodon (skenování). Rozpoznání počátečního tripletu vede k disociaci iniciačních faktorů a nasednutí velké ribozomální podjednotky (60S) za vzniku funkčního 80S iniciačního komplexu, který může pokračovat do další fáze - elongace. Eukaryotický iniciační factor 3 (eIF3) hraje zásadní roli během všech fází iniciace translace. Nicméně molekulární detaily nejsou zcela známé. Během předešlých in vivo studií bylo připraveno mnoho mutací v eIF3, přičemž některé se zdají být defektivní buď v tvorbě 43S PIC, nebo v pozdějších fázích iniciace. Abychom porozuměli přesné úloze eIF3 v tomto procesu na molekulární úrovni, provádíme rozbor jednotlivých funkcí podjednotek eIF3 v iniciaci translace za použití vyizolovaných mutantních eIF3 komplexů v in vitro rekonstituovaném systému.
|
|
|
Hledání lidských bílkovin ovlivňujících funkci IRES viru hepatitidy typu C
Roučová, Kristina ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Kuthan, Martin (oponent)
Virus žloutenky typu C (HCV) představuje celosvětově rozšířený patogen infikující až 3 % lidské populace. V posledních letech se výzkum nových léčiv proti tomuto viru zaměřuje na jednotlivé kroky v jeho životním cyklu, mimo jiné na iniciaci translace. V případě HCV je iniciace translace závislá na vnitřním vazebném místě pro ribozóm (IRES) a kromě složek translačního aparátu se na ní podílí i další buněčné komponenty tzv. IRES trans-účinkující faktory (ITAF). Tato práce navazuje na předchozí výzkum naší laboratoře zaměřený na hledání nových ITAF. Pro hledání potenciálních ITAF zvyšujících aktivitu IRES HCV byly připraveny nové rekombinantní plazmidové vektory, nové referenční kvasinkové kmeny a byly optimalizovány selekční podmínky připraveného sytému. Rozdíly v růstových vlastnostech referenčních kmenů byly zkoumány a kvantifikovány v selekčních i neselekčních podmínkách. Dále byla provedena série pilotních vysokovýtěžkových transformací kvasinkového kmene pJ69-4A, nesoucího bicistronní konstrukt s IRES HCV, lidskou expresní cDNA knihovnou s cílem optimalizovat transformační účinnost a selekční podmínky a v neposlední řadě i s cílem pokusit se identifikovat nové ITAF. Několik desítek náhodně vybraných klonů získaných v selekčních podmínkách z těchto transformací bylo podrobeno analýze růstových vlastností,...
|
|
|
Studium a podjednotky lidského translačního iniciačního faktoru 3 (eIF3) metodou RNA interference.
Peclinovská, Lucie ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Martínková, Markéta (oponent)
Iniciace translace je klíčovým krokem proteosyntézy, který umožňuje regulaci genové exprese. Regulace na úrovni přepisu mRNA je nejrychlejším možným mechanismem. Celý proces je ovlivňován mnoha iniciačními faktory. Jedním z eukaryotických iniciačních faktorů, který participuje na celé řadě procesů během iniciace translace je eIF3. Za jeho velice efektivní, a pro iniciaci translace nezbytnou, alespoň v kvasinkách, byla označena největší podjednotka p170, též nazývaná eIF3a. Tato práce si klade za cíl, utvořit komplexní náhled na eIF3a, přičemž hodlá vycházet z poznatků nabytých sledováním této podjednotky v Saccharomyces cerevisiae. Snížení exprese eIF3a, které umožňuje pozorovat vliv této podjednotky pomocí různých experimentů v porovnání s kontrolní skupinou, je "navozeno" metodou RNA interference. Na eIF3a je zde nahlíženo z pohledu i) životaschopnosti buněk metodou využívající 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl- -tetrazolium bromid (MTT testu) ; ii) sleduje se vliv podjednotky na celkovou expresi proteinu inkorporací 35 S-methioninu a iii) v neposlední ředě je v této práci ukázán vliv snížené exprese eIF3a na tvorbu polysomů.
|
|
|
Minoritní proteiny viru hepatitidy typu C
Zeman, Jakub ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Horníková, Lenka (oponent)
Virus žloutenky typu C (HCV) je hlavním původcem chronických onemocnění jater. Po celém světě je v současnosti více než 170 milionů chronicky infikovaných osob, u více jak 100 tisíc z nich se ročně rozvine hepatocelulární karcinom. HCV náležící do čeledi Flaviviridae je obalený jednořetězcový RNA virus s pozitivním vláknem (+ssRNA virus), jehož genom kóduje polyproteinový prekursor, z kterého vzniká pro štěpení buněčnými a virovými proteasami 10 virových proteinů. Mimo to je však virem kódován ještě minoritní protein v alternativním čtecím rámci. Tento protein vzniká v několika možných variantách posunem čtecího rámce či iniciací translace na vnitřních startovacích kodonech. Přes deset let výzkumu není jeho role in vivo v současné době známa. Ukazuje se, že pro robustní virovou translaci a replikaci jsou spíše než přítomnost minoritních proteinů důležité sekundární struktury v core oblasti genomu HCV. Mutace narušující tyto struktury můžou mít za následek zpomalení kinetiky virového cyklu, ale i, jak naznačuje nejnovější studie, zcela neobvyklý sérologický profil u pacientů a zvýšenou míru exprese minoritního proteinu.
|
|
|
Funkce mTORC1 komplexu v regulaci iniciace translace.
Holásková, Lucie ; Feketová, Zuzana (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Práce se zabývá charakteristikou mTOR a jeho účasti na regulaci iniciace translace. Především se zaměřuje na ovlivnění iniciace translace. mTOR protein je součástí dvou komplexů, které se v organismech vyskytují - mTORC1 a mTORC2. Eukaryotický iniciační faktor 4E (eIF4E) hraje důležitou roli při kontrole iniciace translace. Aktivita eIF4E proteinu je regulována represorovými proteiny z rodiny 4E binding proteins (4E-BPs). Navázání těchto proteinů na eIF4E je regulováno stavem jejich fosforylace. Aby došlo k uvolnění 4E-BP1 z eIF4E musí dojít k fosforylaci na čtyřech fosforylačních místech (Thr37, Thr46, Ser65 a Thr70). Práce přináší formou rešerše i přehled některých dalších dějů, které se u mTOR dráhy vyskytují.
|
|
|
Úloha eIF3 v přenosu mRNA na 43S preiniciačni komplex
Beznosková, Petra ; Mašek, Tomáš (oponent) ; Valášek, Leoš (vedoucí práce)
Jedním z důležitých momentů genové exprese u eukaryot je iniciace translace, která je závislá na souhře mnoha eukaryotických iniciačních faktorů, malé (40S) a velké (60S) podjednotky eukaryotního ribosomu, mRNA a iniciační methionyl tRNA. Eukaryotický iniciační faktor 3 (eIF3), který je největší ze všech faktorů, se podílí na drtivé většině reakcí v průběhu iniciace translace. U kvasinek tvoří multifaktorový komplex (MFC) společně s eIF1,eIF5 a ternárním komplexem (TC; eIF2-GTP-Met-tRNAi Met komplex) a stimuluje formováni tzv. 43S preiniciačního komplexu. eIF3 hraje roli rovněž při nasedání mRNA na ribosom, skenování 5' nepřekládaného konce mRNA za účelem rozpoznání AUG iniciačního kodónu, a zdá se, že se významně účastní i genově-specifického regulačního mechanismu translace zvaného reiniciace, který využívá tzv. krátké otevřené čtecí rámce v 5'nepřekládané oblasti mRNA (uORF).
|
host ::
RSS.