|
|
Strukturní studie inhibičních mechanismů kinas fosfatidylinositolu.
Gregor, Jiří ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent)
+ssRNA viry po vstupu do buňky tvoří platformy pro svoji replikaci - replikační organely. V těchto oblastech je díky činnosti fosfatidylinositol 4-kinasy zvýšená koncentrace PI4P, který vytváří vhodné prostředí pro vazbu virové polymerasy 3DPOL . Jednou z těchto kinas je PI4KB, která je vázána na membránu prostřednictvím ACBD3 proteinu, který je sám k membráně vázán interakcí s giantinem. Některé kobuviry a enteroviry z čeledi Picornaviridae pomocí nestrukturního proteinu 3A vytěsní ACBD3 protein z vazby s gigantinem a přemístí ho z Golgiho aparátu do replikační organely. Na ACBD3 se zde váže PI4KB a následně katalyzuje vznik PI4P. V Golgiho aparátu byly objeveny pouze dva proteiny - TBC1D22A a TBC1D22B - které se váží do stejného místa ACBD3 proteinu jako PI4KB. Cílem této práce bylo ověřit interakci peptidů z proteinů TBC1D22A a TBC1D22B s ACBD3 proteinem a zjistit sílu této interakce. Dalším cílem bylo vykrystalizovat komplexy těchto interakčních partnerů a následně vyřešit jejich trojrozměrné struktury. Bylo zjištěno, že interakce ACBD3 proteinu s peptidy TBC1D22A a TBC1D22B je mnohem slabší než interakce ACBD3 s PI4KB. Podařilo se připravit krystaly komplexu ACBD3 s TBC1D22A, ale bohužel difraktovaly jen k velmi nízkému rozlišení, a tudíž struktura nemohla být vyřešena.
|
|
|
DNA damage-inducible protein: interakce s proteinovými partnery a potenciální role v proteasomální degradaci proteinů
Belza, Jan ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Proteiny podobné Ddi1 ( z angl. "DNA damage-inducible proteins") byly zatím nejlépe charakterisovány v kvasince (protein Ddi1 ze Saccharomyces cerevisiae), v octomilce (protein Rngo z D. melanogaster) a nedávno i v člověku (protein Ddi2). Podle své doménové architektury jsou přiřazovány k proteasomálním adaptorovým proteinům, jejichž funkcí je dopravovat ubikvitinylované substráty k degradaci do proteasomu. Obsahují totiž domény podobné ubikvitinu (UBL) zodpovědné za vazbu na proteasom a domény asociované s ubikvitinem (UBA), zodpovědné za vazbu na ubikvitinované proteiny. Vedle toho však zřejmě mají v organismu i další funkce. Kvasinkový homolog Ddi1 je zapojen do řízení buněčného cyklu, hraje roli při degradaci HO endonukleasy a pravděpodobně také jako negativní regulátor exocytosy. Buněčné funkce nedávno identifikovaného lidského homologu Ddi2 zatím nejsou známy. Abychom přispěli k pochopení fysiologických funkcí lidského proteinu Ddi2, rozhodli jsme se identifikovat možné interakční partnery tohoto proteinu. Připravili jsme proto DNA konstrukty pro expresi proteinu Ddi2 v savčích buňkách HEK293 ve fúzi s afinitními značkami FLAG, HA a Myc, umožňujícími jejich snadnou visualizaci a purifikaci. Afinitní chromatografií spřaženou s hmotnostní spektrometrií (AP-MS) jsme identifikovali několik...
|
|
| |
|
|
Mikrokalorimetrie jako methoda studia interakcí proteinu s ligandy
Durčák, Jindřich ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Interakce proteinů s vazebnými partnery se vyskytují u všech živých organismů, takřka u každého buněčného procesu. Studium proteinových interakcí proto tvoří významnou část biochemického výzkumu. Ukazuje se, že ještě cennější, než získání rovnovážných konstant těchto dějů, je určení hodnot jednotlivých energetických složek, tedy změn enthalpie a entropie. Pro termodynamickou analýzu vzniku komplexu vazebných partnerů, tedy pro určení hodnot změn entropie a enthalpie, lze využít isothermální titrační kalorimetrii (ITC). Mikrokalorimetrie se tak stává důležitou optimalizační technikou při vývoji nových léčiv, například protivirových látek. Přestože je virus HIV známý přes 30 let, intenzivní výzkum nepřinesl ani vakcínu ani lék, který by trvale vyléčil pacienty. Bylo schváleno již 26 léků, z nichž většina cílí virové enzymy reversní transkriptasu a proteasu. Antiretrovirální léčba brání množení HIV a udržuje v chodu imunitní systém, avšak dlouhodobé užívání vede k resistenci vůči farmakům, která je způsobena mutacemi v cílových proteinech. Jeden z poměrně nových cílů terapeutického zásahu je formování kapsidy při vzniku nových virionů. Při skládání kapsidy dochází k mnoha protein - proteinovým interakcím, které jsou nezbytné při tvorbě infekčních virových částic. Jako účinný inhibitor skládání kapsidy...
|
|
|
Hmotnostní spektrometrie v proteomice: strukturní biologie a klinické aplikace
Pavlásková, Kateřina ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Obšilová, Veronika (oponent) ; Hernychová, Lenka (oponent)
Hmotnostní spektrometrie (MS) je rychlá, specifická, citlivá a experimentálně variabilní metoda, kterou lze s úspěchem použít v celé řadě proteomických aplikací, např. při identifikaci a řešení primární struktury proteinů nebo pro studium terciární struktury a protein-proteinových interakcí. Zavedení tzv. měkkých ionizačních technik na konci 80. let minulého století umožnil ionizovat bez nežádoucí fragmentace biologické makromolekuly jako jsou proteiny, oligosacharidy nebo nukleové kyseliny, a tak nejvíce ovlivnil využití hmotnostní spektrometrie na poli proteomiky. Cílem této práce bylo použití současných přístupů hmotnostní spektrometrie při řešení několika proteomických otázek. První část práce je zaměřena na studium terciární struktury a protein-proteinových interakcí pomocí kombinace techniky chemického zesítění s MS analýzou ve třech modelových systémech: (1) homodimeru lidského regulačního proteinu 14-3-3, (2) systému proteinu 14-3-3 s regulační doménou tyrosinhydroxylasy, a (3) systému dvou membránových proteinů účastnících se biotransformace xenobiotik - cytochromu P450 2B4 a cytochromu b5. Tento metodický přístup pracuje s proteiny ve vodných roztocích za fyziologických podmínek a zachovává tak jejich nativní struktury. Ve druhé části práce byly pomocí MS studovány proteinové profily...
|
|
|
Studium inkorporace modifikovaných aminokyselin do cytochromu b5
Koberová, Monika ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Pavlásková, Kateřina (oponent)
Cytochrom b5 (cyt b5) může ovlivňovat reakce katalyzované cytochromy P450, a v důsledku toho se může podílet i na aktivaci látek (například léčiv, karcinogenů) případně ovlivňovat poměry vzniklých metabolitů. Mechanismu působení cyt b5 ještě nebyl zcela objasněn. Přínosem k objasnění mechanismu by mohlo být zjištění protein-proteinových interakcí v monooxygenasovém systému, kterého je tento protein součástí. Pro studium těchto interakcí pomocí síťovacích technik je vhodné připravit fotolabilní cyt b5, který by se po fotoaktivaci stal vysoce reaktivním a vytvořil by komplex s nejbližšími složkami v monooxygenasovém systému.Tato práce se zabývá vypracováním metody pro produkci rekombinantního cyt b5 s modifikovanými aminokyselinami. Cyt b5 byl exprimován v bakteriálním kmeni E.coli BL-21 (DE3) Gold. Před indukcí exprese byly bakterie převedeny do limitního media (DMEM-LM), které neobsahovalo L-leucin a L-methionin. Limitní mediu bylo doplněno modelovou deuterovanou aminokyselinou d3-methyl-L-methioninem a D,L-leucinem. Exprimovaný cyt b5 byl izolován a inkorporace d3-methyl-methioninu byla ověřena hmotnostní spektrometrií. V úvodních experimentech byl cyt b5 získán převážně jako apoprotein (apo-cyt b5). Pro zvýšení inkorporace hemu do apo-cyt b5 byl studován vliv teploty na inkorporaci hemu při...
|
|
|
Fyzické interakce sestřihového faktoru Prp45
Kratochvílová, Eliška ; Folk, Petr (vedoucí práce) ; Doubravská, Lenka (oponent)
Je známo, že posttranslační stav chromatinu, transkripce a sestřih se vzájemně ovlivňují, přesto ve studiu jejich vztahů zbývá ještě mnoho nezodpovězených otázek. V kvasince Saccharomyces cerevisiae lze relativně snadno navodit stavy, kdy je v životaschopných buňkách sestřih oddělen od transkripce. Takového stavu bylo docíleno mutací sestřihového faktoru Prp45, jehož savčí homolog se prokazatelně účastní jak regulace transkripce, tak sestřihových reakcí. Na základě předem indikovaných interakcí v dvouhybridním systému byla v této práci hledána fyzická spojení proteinu Prp45 s proteiny účastnícími se posttranslačních modifikací chromatinu. Jejich nalezení by poskytlo vhled do vzájemných vztahů procesů genové exprese. Koimunoprecipitací ani afinitní purifikací nebyly nalezeny fyzické interakce mezi proteinem Prp45 a námi zvolenými regulátory chromatinu. O alternativních přístupech uvažujeme. Koprecipitačními metodami byla dále blíže lokalizována interakce proteinu Prp46 se zkrácenými variantami proteinu Prp45. Toto pozorování rozšířilo naše znalosti o protein- proteinových interakcích v rámci sestřihového komplexu.
|
host ::
RSS.