|
|
Úloha signalizace přes substrátovou doménu proteinu p130Cas pro migraci, invazivitu a metastázování nádorových buněk
Zemanová, Kateřina ; Brábek, Jan (vedoucí práce) ; Čáslavský, Josef (oponent)
p130Cas (Crk-associated substrate) byl poprvé popsán před více než 30 lety jako protein, který asociuje s onkoproteiny v-src a v-crk a který je hojně fosforylován. Proteiny z rodiny CAS jsou nedílnou součástí buněčně biologických procesů za normálních i patologických situací. Pro substrátovou doménu je charakteristické 15 opakovaní motivu YXXP. p130Cas je adaptorový protein, který podporuje interakce mezi proteiny nezbytné pro tvorbu multiproteinových komplexů. Protein p130Cas reguluje tyto multiproteinové komplexy, které dále řídí chemotaxi, apoptózu, diferenciaci a migraci. Nadprodukce proteinů CAS byla zaznamenána v souvislosti se špatnou prognózou a zvýšeným výskytem metastází. Stejně tak souvisí zvýšená produkce proteinů z CAS rodiny s rezistencí na některé druhy chemoterapeutik.
|
|
|
Functional analysis of the internally disordered structure of the substrate domain in p130Cas protein biology
Hejnarová, Marie ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Gemperle, Jakub (oponent)
Protein p130Cas je významným mechanosenzorem v buněčných adhezivních strukturách, jako jsou fokální adheze a podozomy. Zde je protein vystaven mechanické tenzi, která je zák- ladem jeho zapojení do integrinové signalizace. Na úrovni p130Cas je následně mechanická síla přeměněna na chemický signál. Přestože p130Cas nevykazuje enzymatickou aktivitu, jeho silný vazebný potenciál z něj činí důležité signalizační propojení, které zajišťuje distribuci signálu do různých buněčných drah. Díky tomu má p130Cas velký vliv na i tak zásadní buněčné procesy jako jsou proliferace, diferenciace a pohyb buněk. Kromě jeho nezastupitelné role v embry- onálním vývoji byla také popsána účast na vzniku patologií. Jakožto hlavní substrát pro Src kinázu se p130Cas může podílet na signalizacích vedoucích k nádorové transformaci a dalšímu malignímu vývoji. Jeho zvýšená exprese je pozorována převážně u agresivních typů nádorů tvořících metastáze, jako jsou karcinomi prsu, prostaty a nebo melanomy. V posledních letech se proto diskutuje možné využití proteinu p130Cas jako potenciálního cíle pro vyvíjená migras- tatika. V rámci této práce se zabýváme funkční analýzou substrátové domény proteinu p130Cas. Právě tato doména je zodpovědná za mechanosenzorické vlastnosti tohoto proteinu a zárověň představuje substrát pro kinázy...
|
|
|
Adaptor domains in signalling proteins: phosphorylation analysis and a role in mechanosensing
Tatárová, Zuzana ; Novotný, Marian (vedoucí práce) ; Doležal, Pavel (oponent)
P130Cas (Crk-associated substrate, CAS) je důležitým adaptorovým proteinem v integrínové signalizaci, který pozitivně ovlivňuje motilitu, invazivitu, proliferaci a přežívání buněk. CAS postrádá enzymatickou funkci, ale po vazbě jiných signálních proteinu může dojít ke změně fosforylace substrátové domény CAS, což je hlavní způsob, jakým se CAS účastní regulace signálních mechanismů v buňce. Ve fokálních adhezích dochází k lokálnímu pnutí, což vede k natažení substrátové domény, zpřístupnění fosforylačních míst pro kinázy a následně ke zvýšené fosforylaci substrátové domény. Na N-konci je CAS ve fokálních adhezích ukotven pravděpodobně interakcí SH3 domény CAS s kinázou FAK, avšak o ukotvení C-koncové části proteinu CAS není zatím nic známo. Cílem mého projektu je zjistit, jaké proteiny se podílejí na ukotvení proteinu CAS do fokálních adhezí. Objasnění způsobu ukotvení proteinu CAS do fokálních adhezí přispěje k pochopení mechanorecepční funkce proteinu CAS. Experimentální data poukazují na to, že tyrosinová fosforylace SH3 domény proteinu CAS ovlivňují její vazebné vlastnosti. Druhým cílem mého projektu bylo bioinformaticky analyzovat význam tyrosinové fosforylace SH3 domény a jiných adaptorových domén.
|
|
|
The biological importance of CAS SH3 domain tyrosine phosphorylation
Janoštiak, Radoslav ; Brábek, Jan (vedoucí práce) ; Dvořák, Michal (oponent)
Proteín CAS je hlavný tyrozín-fosforylovaný proteín v bunkách transformovaných virovými onkogénmi v-src a v-crk. Je to multidoménový adaptorový proteín slúžiaci ako lešenie pre zostavovanie signálnych komplexov dôležitých pre migráciu a invazivitu Src-transformovaných buniek. V N-koncovej SH3 doméne proteínu CAS bolo identifikované nové fosforylačné miesto - tyrozín 12 nachádzajúci sa na väzbovom povrchu SH3 domény. Pre štúdium biologického významu fosforylácie tyrozínu 12 boli pripravené nefosforylovateľná ( Y12F ) a fosfomimikujúca ( Y12E ) mutanta proteínu CAS. Zistili sme, že fosfomimikujúca mutácia Y12E znižuje asociáciu s kinázou FAK a fosfatázou PTP-PEST a taktiež znižuje tyrozínovú fosforyláciu kinázy FAK. Pomocou GFP značeného proteínu CAS sme následne zistili, že Y12E mutácia delokalizuje proteín CAS z fokálnych adhézií, pričom však nemá žiadny vplyv na lokalizáciu CAS do podozómov. Nefosforylovateľná mutácia Y12F zapríčiňuje hyperfosforyláciu substrátovej domény CAS a znižuje dynamiku fokálnych adhézií a s tým spojenú migračnú kapacitu myších embryonálnych fibroblastov ( MEF ) nezávisle na integrínovej signlizácii. Analogicky k migrácii, CAS Y12F znižuje i invazivitu Src-transformovaných MEF. Z výsledkov tejto diplomovej práce vyplýva dôležitosť fosforylácie Tyr 12 v SH3 doméne CAS pre...
|
|
|
Crosstalk of integrin and mTOR signaling
Teglová, Lucie ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Libus, Jiří (oponent)
Propojení integrinové a mTOR signalizace je buněčným procesem, který umožňuje regulovat buněčný růst na základě interakce buňky s okolním prostředím. Přestože informace o adhezivním stavu buňky přenášené integrinovou signalizací jsou pro růst buňky podstatné, vlastní propojení obou drah je poměrně málo popsáno. V této diplomové práci ukazujeme na některé aspekty toho propojení zjištěné za pomocí dvou odlišných přístupů. V první části práce bylo studováno ovlivnění mTOR dráhy proteinem p130Cas v buňkách transformovaných aktivovaným Src onkoproteinem. p130Cas je adaptorový protein, který reguluje především buněčný pohyb a přežívání a je v odpověď na aktivací integrinů fosforylován kinázou Src a kinázou adhezivních folků. V nedávné době bylo také popsáno zapojení proteinu p130Cas do procesů buněčné invazivity a metastazování. V této diplomové práci ukazujeme, že buňky nadprodukující protein p130Cas vykazují stimulaci mTOR dráhy. Tento jev je pravděpodobně závislý na substrátové doméně p130Cas proteinu. Druhá část práce se zabývá vlivem proteinu Rheb na integrinovou signalizaci. Pro studium zapojení proteinu Rheb byly vytvořeny stabilní linie exprimující různé varianty tohoto proteinu. Tyto linie byly následně charakterizovány z hlediska ovlivnění mTOR signalizace, buněčného cyklu a integrinové...
|
|
|
Hledaní nových interakčních partnerů SH3 domény adaptorového proteinu p130Cas
Gemperle, Jakub ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Forstová, Jitka (oponent)
Protein p130Cas patří mezi hlavní tyrosin-fosforylované proteiny v buňkách transformovaných onkogeny v-crk a v-src. Jeho exprese je nezbytná pro invazivitu a tvorbu metastází v buňkách transformovaných aktivovanou kinázou Src. Vysoké hladiny exprese proteinu p130Cas u pacientů s rakovinou prsu jsou spojeny s větším rizikem návratu choroby, slabou odpovědí na léčbu tamoxifenem a horší prognózou. V netransformovaných buňkách je p130Cas fosforylován v substrátové doméně po stimulaci integrinů, což ovlivňuje buněčnou migraci a dynamiku cytoskeletu. Na této signalizaci se nepostradatelně podílí právě SH3 doména p130Cas. V této diplomové práci jsme jako první analyzovali pomocí metody Phage display a následně charakterizovali vazebný motiv SH3 domény p130Cas. Na základě tohoto vysokoafinitního motivu [AP]P[APMS]-K-P-[LPST]-[LR]-[LPST] jsme predikovali nové interakční partnery proteinu p130Cas a následně potvrdili interakci se Ser/Thr kinázou PKN3. Tato kináza kolokalizuje s p130Cas v jádře a perinukleární oblasti a mohla by p130Cas fosforylovat. V rámci této diplomové práce jsme také analyzovali vliv fosfomimikující mutace tyrosinu ze sekvence ALYD, která je konzervovaná v sekvenci SH3 domén, na schopnost těchto domén vázat ligandy. Tato mutace snižovala vazbu asi o 3 řády jak k ligandům I. třídy (SH3...
|
|
|
Analyzing the role of the p130Cas SH3 domain in p130Cas-mediated signaling
Gemperle, Jakub ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent) ; Truksa, Jaroslav (oponent)
IN CZECH Adaptorový protein p130Cas (CAS, BCAR1) propojuje signalizaci od integrinových receptorů s receptory růstových faktorů a ovlivňuje správný embryonální vývoj a tkáňovou homeostázu. Jeho změněná exprese může vyvolat mnoho patologických stavů, včetně nádorového bujení, metastazování a rezistence vůči různým protinádorovým lékům. Molekulární mechanismy, jakými p130Cas přispívá k různým patologickým stavům nejsou zatím jednoznačně popsány. Cílem mé doktorské práce bylo tedy poskytnout nové poznatky o signalizaci p130Cas a o její regulaci. Doména SH3 je nepostradatelná pro signalizaci proteinu p130Cas, ale její vazebné preference/regulace nebyly dosud přesně charakterizovány ani strukturně popsány. Proto jsme začali spolupracovat se skupinou Dr. Veverky (Strukturní biologie) a Dr. Lepšíkem (Výpočetní biochemie, AV ČR). S jejich pomocí jsme pak připravili fúzní chiméry SH3 domény proteinu p130Cas se svými ligandy a provedli strukturní analýzu NMR, která nám pomohla strukturně popsat atypický vazebný motiv SH3 domény proteinu p130Cas. Díky této spolupráci jsem se navíc naučil, jak tyto struktury vizualizovat a analyzovat. Tato práce rozšířila naše znalosti o regulaci vazby mezi p130Cas SH3 a jejími ligandy a dále vedla k vylepšenému modelu vazby mezi Src-p130Cas-FAK. Naše snaha sledovat aktivitu...
|
|
|
Role proteinu p130CAS v odpovědi na mechanický stres
Braniš, Jaroslav ; Brábek, Jan (vedoucí práce) ; Gregor, Martin (oponent)
Snímání mechanických stimulů proteiny a jejich přeměna do biochemických signálů v procesu tzv. mechanotransdukce je v poslední době velmi diskutovaným tématem v buněčné biologii. Hlavními molekulami, které buňka využívá ke snímání mechanických stimulů, jsou povrchové membránové proteiny, které přenáší mechanický impuls do buňky. V buňce se pak vyskytují komplexy proteinů, které signál přenáší dále. Jedním z nejdůležitějších proteinů, který má schopnost měnit mechanické impulsy na biochemické signály a přenášet je na další proteiny je p130Cas. Tato práce se zabývá schopností proteinu p130Cas snímat mechanické impulsy a přenášet je na další proteiny signálních drah a tím regulovat buněčnou odpověď v závislosti na mechanickém stresu. Klíčová slova: p130Cas, p130Cas/Crk komplex, mechanický stres
|
|
|
Příprava a testování nového proteinového senzoru mechanické tenze
Kolomazníková, Veronika ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Novotný, Ivan (oponent)
Protein p130Cas (lidský ortholog BCAR1) je jedním z hlavních substrátů kinázy Src a hraje tak důležitou roli v nádorové transformaci. Zvýšená exprese BCAR1 koreluje s růstem primárního nádoru, jeho agresivitou a zhoršenou prognózou onemocnění. Ve chvíli, kdy je protein lokalizován do fokálních adhezí slouží jako buněčný mechanosenzor a zprostředkovává interakci buňky s extracelulárním prostředím. Pro fungování proteinu jsou klíčové kotvící domény SH3 a CCH spolu se substrátovou doménou, která může být vlivem aplikované tenze natahována. Diplomová práce představuje nově zkonstruovaný FRET-biosenzor mechanické tenze založený na struktuře proteinu p130Cas. Senzor využívá kotvící domény p130Cas, díky kterým lokalizuje do fokálních adhezí a může detekovat mechanickou tenzi v živých buňkách. Klíčová slova: p130CAS, FRET, fokální adheze, mechanorecepce
|
|
|
Úloha signalizace přes substrátovou doménu proteinu p130Cas pro migraci, invazivitu a metastázování nádorových buněk
Zemanová, Kateřina ; Brábek, Jan (vedoucí práce) ; Čáslavský, Josef (oponent)
p130Cas (Crk-associated substrate) byl poprvé popsán před více než 30 lety jako protein, který asociuje s onkoproteiny v-src a v-crk a který je hojně fosforylován. Proteiny z rodiny CAS jsou nedílnou součástí buněčně biologických procesů za normálních i patologických situací. Pro substrátovou doménu je charakteristické 15 opakovaní motivu YXXP. p130Cas je adaptorový protein, který podporuje interakce mezi proteiny nezbytné pro tvorbu multiproteinových komplexů. Protein p130Cas reguluje tyto multiproteinové komplexy, které dále řídí chemotaxi, apoptózu, diferenciaci a migraci. Nadprodukce proteinů CAS byla zaznamenána v souvislosti se špatnou prognózou a zvýšeným výskytem metastází. Stejně tak souvisí zvýšená produkce proteinů z CAS rodiny s rezistencí na některé druhy chemoterapeutik.
|
host ::
RSS.