|
|
Využití fluorescenčních metod pro studium proteinových interakcí
Johaníková, Klára ; Bezděková,, Jaroslava (oponent) ; Pavelicová, Kristýna (vedoucí práce)
Diplomová práce s názvem „Využití fluorescenčních metod pro studium proteinových interakcí“ je zaměřená na využití fluorescenčních metod pro studium proteinových interakcí pomocí elektromigračních metod a Försterova resonančního přenosu energie (FRET). Cílem této práce bylo vytvoření biokonjugátu proteinu metallothioneinu (MT) s kvantovými tečkami (QDs) a komerčními barvivy. Mezi těmito konjugáty byl následně studován FRET. QDs byly syntetizovány za působení UV záření a konjugace s MT byla provedena přes karbodiimidový zerolengthcrooss-linker (EDC/sulfo-NHS), který slouží k aktivaci karboxylových skupin a umožňuje biokonjugaci ligandu kovalentní vazbou. Díky vysokému podílu cysteinů v MT, má tento protein velmi vysokou afinitu ke kovům. Podílí se také na vychytávání volných radikálů a jsou i studie, které dokazují, že dochází ke zvýšené expresi MT v oblasti rakovinných buněk-nádorů. Pozornost byla věnována i studiu dimerizace MT, která vede k pochopení oxidativní dimerizace MT a tím může přispět k pochopení vzniku volných radikálů v těle a k prohloubení znalostí o neurodegenerativních poruchách jako je Parkinsnova nebo, Alzheimerova choroba či amyotrofická laterální skleróza. Vznik dimeru MT, byl potvrzen přenosem energie mezi donorem (QDs) a akceptorem (komerční barvivo-cyanin) skrze fyzikální jev FRET i pomocí MALDI-TOF-MS.
|
|
|
Diferenční pulzní voltametrie pro detekci metallothioneinu
Postránecká, Tereza ; Prášek, Jan (oponent) ; Provazník, Ivo (vedoucí práce)
Metalothionein (MT) je protein s charakteristickým aminokyselinovým složením, který díky svým thiolovým skupinám dokáže vázat ionty kovů a zapojovat se tak do homeostázy těchto iontů v organismu. Protein má svůj význam i v procesu karcinogeneze, mohl by být vhodným markerem u některých typů nádorů. MT má v organismech mnoho specifických funkcí. Může být zkoumán několikerými technikami. Běžně používanou metodou stanovení koncentrace MT je elektroanalýza. Konkrétněji se v této práci zaměřuji na diferenční pulzní voltametrii za využití Brdičkovy reakce.
|
|
|
Studium konjugátů metalothioneinu pomocí elektromigračních metod
Johaníková, Klára ; Zemánková, Kristýna (oponent) ; Vaculovičová, Markéta (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá studiem konjugátů metallothioneinu (MT) s fluorescenčními nanočásticemi pomocí elektromigračních metod. Pozornost je věnována především přípravě a charakterizaci kvantových teček (QDs) a jejich biokonjugátů s proteinem metallothioneinem, jehož separační podmínky (koncentrace a vhodné pH elektrolytu) byly pečlivě optimalizovány. Pro přípravu QDs bylo využitopůsobení UV záření pro jeden typ kvantových teček a termického působení vysoké teploty pro typ druhý. Konjugace QDs s proteinem byla provedena přes karbodiimidovýzero-lengthcrooss-linker (EDC/sulfo-NHS), který slouží k aktivaci karboxylových skupin a umožňuje biokonjugaci ligandu kovalentní vazbou. Výsledné biokonjugáty byly studovány pomocí kapilární elektroforézy s absorpční detekcí ( 214).
|
|
| |
|
|
Čipová a kapilární elektroforéza pro výzkum rakoviny
Hájková, Tereza ; Babula, Petr (oponent) ; Provazník, Ivo (vedoucí práce)
Práce se zabývá problematikou nádorového onemocnění a jeho vznikem. Karcinom prostaty je druhý nejzávažnější karcinom u mužů, je důležité zaměřit se na včasnou detekci. Tato práce pojednává o proteinech, které jsou nebo by mohly být využity jako potenciální nádorové markery. Například v současnosti běžně používaný prostatický specifický antigen, ale nově i metalothionein. Metalothionein je protein vyskytující se v rostlinné i v živočišné říši ve čtyřech základních isoformách. Existuje předpoklad, že obsah jednotlivých isoforem, případně jejich vzájemný poměr, má určitý diagnostický potenciál, který by mohl být využitelný v praxi. Z tohoto důvodu jsou vyvíjeny a studovány metody pro specifickou a citlivou analýzu jednotlivých isoforem. V této práci je pro separaci isoforem využita kapilární elektroforéza a jsou diskutovány vlivy jednotlivých parametrů (druh základního elektrolytu, jeho pH, velikost separačního napětí a tak dále) na výslednou separaci.
|
|
|
Potenciální vliv tkáňově specifických transkripčních faktorů na expresi metalothioneinů
Michálková, Nikola
Metalothioneiny představují skupinou intracelulárních proteinů, které jsou schopné vázat kovové ionty a jejich funkce zahrnuje regulaci buněčných hladin těchto kovových iontů. Transkripční faktory jsou centrálními regulátory genové exprese a hrají důležitou roli v regulaci genové exprese metalothioneinů, která představuje základní mechanismus pro buněčnou odpověď na změny hladin kovových iontů. Ačkoli jsou známy transkripční faktory, které se vážou na oblasti promotoru metalothioneinů, jejich role při bazální a indukované genové expresi metalothioneinů není zcela objasněna. Předmětem této diplomové práce byla indukce genové exprese metalothioneinů pomocí zinečnatých iontů u buněčných nádorových linií HUH7 (hepatocelulární karcinom) a T47D (karcinom prsu), a následná analýza genové exprese vybraných transkripčních faktorů. Volba transkripčních faktorů byla provedena na základě analýzy TF ChIP-seq dat z databáze ENCODE. Pro experimentální část byly zvoleny transkripční faktory FOXA1, FOXA2, HNF4A, a HNF4G, jejichž vysoké hladiny jsou typické pro jaterní tkáň. Dále byla sledována genová exprese ubikvitárních transkripčních faktorů JUND, NR3C1, RXRA, STAT3, SP1 a MTF1. Statisticky signifikantní změny v genové expresi (RT-qPCR) po krátkodobé expozici (4-6 h) 100 μM ZnSO4 byly pozorovány u FOXA1, JUND a MTF1. V případě FOXA1 byl u obou nádorových linií sledován pokles genové exprese v porovnání s kontrolou, u JUND a MTF1 naopak nárůst exprese po aplikaci ZnSO4. V případě MTF1 byl pozorován signifikantní narůst pouze u nádorové linie HUH7. Výsledky naznačují, že vedle validovaného zinek-responzivního transkripčního faktoru MTF1, by se mohly podílet na regulaci genové exprese metalothioneinů i transkripční faktory FOXA1 a JUND. FOXA1 by mohl představovat potenciální represor a JUND induktor exprese metalothioneinů v reakci na zvýšenou expozici zinečnatým iontům.
|
|
|
Study the optimal condition to knockout metallothionein by CRISPR-Cas9 in neuroblastoma
Májková, Klára
Při léčbě neuroblastomu (Nbl), embryonálního nádoru, který nejčastěji postihuje kojence a děti mladší pěti let, se často používají léčebné strategie založené na cisplatině. Bylo však zjištěno, že účinnost těchto strategií je nižší než 50 % v důsledku chemorezistence nádorových buněk. Tato rezistence byla spojena se zvýšenou expresí metalothioneinů (MTs) v buňkách neuroblastomu. Lidský metalothionein 3 (hMT-3), protein exprimovaný především v buňkách centrální nervové soustavy, hraje zásadní roli v detoxikaci kovů a udržování homeostázy během oxidačního stresu. Knock out metalothioneinu 3 pomocí CRISPR/Cas9 by proto mohl buňky opět učinit citlivými na cytotoxická léčiva. Cílem této studie bylo optimalizovat podmínky pro úspěšné vyřazení MT3 z neuroblastomu. Plazmid MT3-CRISPR/Cas9 byl transfekován do neuroblastomu pomocí přípravku Lipofectamine 2000 ve třech různých koncentracích (250 ng/µl, 500 ng/µl a 1000 ng/µl). Optimálních podmínek bylo dosaženo při použití 0,75 µl přípravku Lipofectamine, 1000 ng/µl plazmidu a 0,5 ng/µl puromycinu.
|
|
|
Vliv expozice těžkých kovů na expresi mRNA isoforem metalothioneinu u adherentních buněčných linií
Jordanová, Lucie
Metalothionein je malý protein bohatý na cystein, který hraje důležitou roli v homeostáze kovů a ochraně před toxicitou těžkých kovů, poškozením DNA a oxidačním stresem. Bakalářská práce byla provedena za účelem zjištění vlivu expozice těžkých kovů na expresi mRNA isoforem metalothioneinu u adherentních buněčných linií. Byl zkoumán vliv expozice zinku ve formě ZnSO4 na expresi mRNA isoforem MT-1A, MT-1X a MT-2A u adherentních buněčných linií rakoviny prsu MCF-7, MDA-MB-231 a T-47D. Pomocí MTT testu viability je zjištěno, jak se mění viabilita buněk při různých koncentracích ZnSO4 a pomocí denaturačního agarózového gelu je ověřena integrita RNA. Pro studium hladin mRNA je využita polymerázová řetězová reakce v kombinaci s reverzní transkripcí qRT-PCR.
|
|
|
Využití fluorescenčních metod pro studium proteinových interakcí
Johaníková, Klára ; Bezděková,, Jaroslava (oponent) ; Pavelicová, Kristýna (vedoucí práce)
Diplomová práce s názvem „Využití fluorescenčních metod pro studium proteinových interakcí“ je zaměřená na využití fluorescenčních metod pro studium proteinových interakcí pomocí elektromigračních metod a Försterova resonančního přenosu energie (FRET). Cílem této práce bylo vytvoření biokonjugátu proteinu metallothioneinu (MT) s kvantovými tečkami (QDs) a komerčními barvivy. Mezi těmito konjugáty byl následně studován FRET. QDs byly syntetizovány za působení UV záření a konjugace s MT byla provedena přes karbodiimidový zerolengthcrooss-linker (EDC/sulfo-NHS), který slouží k aktivaci karboxylových skupin a umožňuje biokonjugaci ligandu kovalentní vazbou. Díky vysokému podílu cysteinů v MT, má tento protein velmi vysokou afinitu ke kovům. Podílí se také na vychytávání volných radikálů a jsou i studie, které dokazují, že dochází ke zvýšené expresi MT v oblasti rakovinných buněk-nádorů. Pozornost byla věnována i studiu dimerizace MT, která vede k pochopení oxidativní dimerizace MT a tím může přispět k pochopení vzniku volných radikálů v těle a k prohloubení znalostí o neurodegenerativních poruchách jako je Parkinsnova nebo, Alzheimerova choroba či amyotrofická laterální skleróza. Vznik dimeru MT, byl potvrzen přenosem energie mezi donorem (QDs) a akceptorem (komerční barvivo-cyanin) skrze fyzikální jev FRET i pomocí MALDI-TOF-MS.
|
|
| |
host ::
RSS.