|
|
Analýza koronavirů metodou QRT-PCR a možnosti terapie pomocí nanoliposomálních nosičů rekombinantních antigenů
Krchová, Lenka ; doc. RNDr. Milan Bartoš. Ph.D. (oponent) ; Turánek, Jaroslav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá studiem koronavirů, jejich diagnostikou a následně možnou konstrukcí rekombinantní vakcíny na bázi liposmálních nosičů rekombinantních antigenů. Experimentální část diplomové práce se dotýká dvou rovin. Nejdřív byla měřena a zkoumána diagnostika viru SARS-CoV-2 metodu real-time PCR. Bylo pracováno s biologickým materiálem velkého počtu pacientů. Společně se základním stanovením přítomnosti viru bylo zkoumáno, jak je virová částice stabilní v čase, jak odolává teplotním změnám, jaký vliv má naředění nosného media na hodnotu Ct a další dílčí experimenty. Ze všech metadat je v závěru vyhodnocena nejpřínosnější varianta pro diagnostiku patogenu. Experimentální část následně navazuje na možnou terapii pomocí rekombinantních vakcín. Tato problematika je velmi aktuální a hýbe celou odbornou veřejností. Byly připraveny liposomy, které v rekombinantních vakcínách slouží jako nosiče bioaktivních látek. Liposomy byly homogenizovány extruzí na požadovanou velikost a různě povrchově modifikovány. Bylo zkoumáno navázání antigenu, stálost v čase a případná degradace. Liposomy byl charakterizovány pomocí DLS, nanoflow cytometrie a elektronové mikroskopie.
|
|
|
Příprava a charakterizace cílených mRNA/DNA transfekčních nanovektorů
Horák, Tomáš ; Chmelíková, Larisa (oponent) ; Skopalík, Josef (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá genetickým inženýrstvím, zejména transfekcí DNA do MSC (Mesenchymal stromal cells) a dendritických buněk. Pro vnesení vektoru do buněk byly odzkoušeny jak lipoplexy, tak kovové magnetické nanočástice. Zkoumání bylo zaměřeno na nalezení účinnějších metod transfekce. Dle analýzy na MADLS a gelové elektroforéze byly zjištěny aspekty hrající důležitou roli při konjugaci a následné transfekci. Konjugace nastává již po 4 minutách, jak dokládá nárůst zeta-potenciálu, avšak pro dosáhnutí plné konjugace je potřeba inkubovat vzorek 20 min. Při neúplné konjugaci na železité nanočástice docházelo k výskytu silných interakcí nosič-nosič, a tím tvoření nežádoucích slepenců. Enkapsulace do lipozómů s kationickou úpravou povrchu proběhla bez komplikací. Úspěšnost exprese proteinu značeného GFP po transfekci těmito metodami byla vyčíslena na 95%, resp. 91%. Tento výsledek je připisován malé cytotoxicitě. Komerční otestované kity na dendritických buňkách však měli úspěšnost pod 5% s vysokou cytotoxicitou.
|
|
|
Příprava a charakterizace cílených mRNA/DNA transfekčních nanovektorů
Horák, Tomáš ; Chmelíková, Larisa (oponent) ; Skopalík, Josef (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá genetickým inženýrstvím, zejména transfekcí DNA do MSC (Mesenchymal stromal cells) a dendritických buněk. Pro vnesení vektoru do buněk byly odzkoušeny jak lipoplexy, tak kovové magnetické nanočástice. Zkoumání bylo zaměřeno na nalezení účinnějších metod transfekce. Dle analýzy na MADLS a gelové elektroforéze byly zjištěny aspekty hrající důležitou roli při konjugaci a následné transfekci. Konjugace nastává již po 4 minutách, jak dokládá nárůst zeta-potenciálu, avšak pro dosáhnutí plné konjugace je potřeba inkubovat vzorek 20 min. Při neúplné konjugaci na železité nanočástice docházelo k výskytu silných interakcí nosič-nosič, a tím tvoření nežádoucích slepenců. Enkapsulace do lipozómů s kationickou úpravou povrchu proběhla bez komplikací. Úspěšnost exprese proteinu značeného GFP po transfekci těmito metodami byla vyčíslena na 95%, resp. 91%. Tento výsledek je připisován malé cytotoxicitě. Komerční otestované kity na dendritických buňkách však měli úspěšnost pod 5% s vysokou cytotoxicitou.
|
|
|
Pevná forma liposomálních systémů pro inhalační podání
Fardová, Lucie ; Kalina, Michal (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Tato diplomová práce je zaměřena na přípravu pevných liposomálních systémů pro inhalační podávání. Liposomální systémy byly připraveny metodou rehydratace fosfolipidového filmu z dipalmitoylfosfatidylcholinu. Pro rehydrataci filmu byl použitý roztok sacharózy, která sloužila jako protektant při sprejovém sušení. Další vzorky liposomů obsahovaly navíc pro lepší stabilizaci cholesterol, kyselinu fosfatidovou nebo polyethylenglykol. Připravené roztoky liposomů byly zkoumány metodami skenovací elektronové mikroskopie, dynamickým rozptylem světla a elektroforetickým rozptylem světla. Vysušené prášky byly podrobeny měření pomocí metod infračervené spektroskopie, termogravimetrické analýzy, rastrovací transmisní elektronové mikroskopie a zjištění aerodynamické velikosti částic. Výsledky dokazují úspěšnou přípravu všech typů liposomálních systémů jejich vysušení do formy prášku a následnou rekonstrukci po rehydrataci vodou i pufrem. Na základě získaných vlastností se jako nejhodnější jevily liposomy s polyethylenglykolem.
|
|
|
Analýza koronavirů metodou QRT-PCR a možnosti terapie pomocí nanoliposomálních nosičů rekombinantních antigenů
Krchová, Lenka ; doc. RNDr. Milan Bartoš. Ph.D. (oponent) ; Turánek, Jaroslav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá studiem koronavirů, jejich diagnostikou a následně možnou konstrukcí rekombinantní vakcíny na bázi liposmálních nosičů rekombinantních antigenů. Experimentální část diplomové práce se dotýká dvou rovin. Nejdřív byla měřena a zkoumána diagnostika viru SARS-CoV-2 metodu real-time PCR. Bylo pracováno s biologickým materiálem velkého počtu pacientů. Společně se základním stanovením přítomnosti viru bylo zkoumáno, jak je virová částice stabilní v čase, jak odolává teplotním změnám, jaký vliv má naředění nosného media na hodnotu Ct a další dílčí experimenty. Ze všech metadat je v závěru vyhodnocena nejpřínosnější varianta pro diagnostiku patogenu. Experimentální část následně navazuje na možnou terapii pomocí rekombinantních vakcín. Tato problematika je velmi aktuální a hýbe celou odbornou veřejností. Byly připraveny liposomy, které v rekombinantních vakcínách slouží jako nosiče bioaktivních látek. Liposomy byly homogenizovány extruzí na požadovanou velikost a různě povrchově modifikovány. Bylo zkoumáno navázání antigenu, stálost v čase a případná degradace. Liposomy byl charakterizovány pomocí DLS, nanoflow cytometrie a elektronové mikroskopie.
|
|
|
Adenylát cyklázový toxin bakterie Bordetella pertussis, jeho konformace a iontová rovnováha v hostitelské buňce.
Motlová, Lucia ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Adenylát-cyklázový (CyaA, ACT) toxin je jedním z hlavních virulenčních faktorů bakterie Bordetella pertussis. Ačkoli se CyaA váže na mnoho typů membrán, předpokládá se, že jeho receptorem je integrin CD11b/CD18, který je exprimován na povrchu myeloidních buněk. CyaA patří do rodiny RTX toxinů-hemolyzinů. CyaA působí na hostitelské buňky dvěma na sobě nezávislými aktivitami. Jednou z nich je přeměna ATP na cyklické AMP, kterou zajišťuje adenylát-cyklázová (AC) doména po translokaci do cytozolu hostitelské buňky, při které dochází ke vstupu vápenatých kationtů do hostitelské buňky. Translokace je pravděpodobně iniciována interakcí monomeru CyaA s cílovou membránou. Druhá aktivita CyaA je tvorba kanálu, selektivního pro kationty, který může způsobit koloidně osmotickou lyzi cílových buněk. Kanálo-tvorná aktivita je zajišťována RTX hemolyzinovou doménou a předpokládá se u ní oligomerizace, i když bylo zjištěno, že únik draselných kationtů z hostitelské buňky způsobuje CyaA ve formě monomeru. Také není jasné, zda by k oligomerizaci CyaA docházelo v roztoku, nebo až po interakci s hostitelskou membránou. Cílem této práce bylo zkoumat tok sodných iontů na membráně myších makrofágů J774A.1, které na svém povrchu exprimují CD11b/CD18 integrin. Pro dosažení tohoto cíle byly použity fluorescenční metody....
|
|
|
Příprava a charakterizace kationických liposomů nesoucích nové imunoadjuvans.
Houšť, Jiří ; Nesměrák, Karel (vedoucí práce) ; Kozlík, Petr (oponent)
Cílem této diplomové práce bylo připravit, charakterizovat a stanovit enkapsulační efektivitu kationických liposomů složených z dimethyldioktadecylamonium bromidu (DDAB) a cholesterolu nesoucích nové léčivo MT05 s imunoadjuvantním účinkem. Byl sledován vliv teploty ultrazvukové lázně a objemu liposomální suspenze na výsledné hodnoty průměrné velikosti liposomů a polydisperzního indexu. Jako nejefektivnější se jevila příprava liposomů pomocí ultrazvukové lázně při 60 řC. Objem liposomů podstupující sonikaci neměl na výsledné hodnoty průměrné velikosti liposomů a polydisperzního indexu vliv, čas sonikace byl šest hodin a mohl by být zkrácen použitím ultrazvukové lázně o vyšším výkonu. Stanovení enkapsulační efektivity metodou HPLC-MS/MS probíhalo ve třech samostatných experimentech. V prvním experimentu byla enkapsulační efektivita kationických liposomů 30,1 ± 8,5 %, ve druhém 43 ± 25 % a ve třetím 32 ± 25 %. Stanovení množství DDAB probíhalo pouze u liposomů připravených při třetím experimentu. Množství DDAB v prvním replikátu očištěných liposomů činilo 78,9 ± 3,7 %, ve druhém 65,4 ± 1,8 % a ve třetím 53,8 ± 1,4 %. Skutečný molární poměr látek MT05 a DDAB u liposomů připravených při třetím experimentu činil u prvního replikátu 1,0:15,8, u druhého 1,0:16,7 a u třetího 1,0:20,5. Klíčová slova:...
|
|
|
Umělé fosfolipidové membrány - metody přípravy, vlastnosti a využití
Hryzáková, Klára ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Sýkora, Michal (oponent)
Heterogenita biologických membrán vedla ke vzniku širokého spektra zjednodušených modelových systémů, jejichž uspořádání, velikost a tvar se dají přizpůsobovat různým aktuálním požadavkům. Existují dva rozdílné přístupy k vytváření umělých fosfolipidových membrán. První z nich je založen na vzniku membrán ve vodném prostředí. Do této skupiny patří černé lipidické membrány, dvojvrstvy na pevném podkladu, dvojvrstvy vzniklé z monovrstev na rozhraní vody a vzduchu a liposomy. Ve druhém případě vznikají dvojvrstevné membrány v množství organické fáze metodou dvojvrstev na kapičkovém rozhraní. Každý typ umělých membrán má své experimentální výhody a nevýhody, což se používá ke studiu různých problémů sahajících od chování jednotlivých fosfolipidů a proteinů až po fúze membrán. Umělé fosfolipidové membrány jsou vhodným nástrojem pro elektrickou charakterizaci dvojvrstev a nebo membránových proteinů. Tato práce je ucelený přehled nejpoužívanějších metod vhodných pro vznik umělých fosfolipidových membrán. Klíčová slova: membrána, lipid, fosfolipidová dvojvrstva, liposom, černá lipidová membrána, dvojvrstvy na pevném podkladu, dvojvrstva na kapičkovém rozhraní Abstract The heterogeneity of biological membranes has led to development of a wide spectrum of simplified model systems whose composition, size and...
|
|
|
Příprava a charakterizace kationických liposomů nesoucích nové imunoadjuvans.
Houšť, Jiří ; Nesměrák, Karel (vedoucí práce) ; Kozlík, Petr (oponent)
Cílem této diplomové práce bylo připravit, charakterizovat a stanovit enkapsulační efektivitu kationických liposomů složených z dimethyldioktadecylamonium bromidu (DDAB) a cholesterolu nesoucích nové léčivo MT05 s imunoadjuvantním účinkem. Byl sledován vliv teploty ultrazvukové lázně a objemu liposomální suspenze na výsledné hodnoty průměrné velikosti liposomů a polydisperzního indexu. Jako nejefektivnější se jevila příprava liposomů pomocí ultrazvukové lázně při 60 řC. Objem liposomů podstupující sonikaci neměl na výsledné hodnoty průměrné velikosti liposomů a polydisperzního indexu vliv, čas sonikace byl šest hodin a mohl by být zkrácen použitím ultrazvukové lázně o vyšším výkonu. Stanovení enkapsulační efektivity metodou HPLC-MS/MS probíhalo ve třech samostatných experimentech. V prvním experimentu byla enkapsulační efektivita kationických liposomů 30,1 ± 8,5 %, ve druhém 43 ± 25 % a ve třetím 32 ± 25 %. Stanovení množství DDAB probíhalo pouze u liposomů připravených při třetím experimentu. Množství DDAB v prvním replikátu očištěných liposomů činilo 78,9 ± 3,7 %, ve druhém 65,4 ± 1,8 % a ve třetím 53,8 ± 1,4 %. Skutečný molární poměr látek MT05 a DDAB u liposomů připravených při třetím experimentu činil u prvního replikátu 1,0:15,8, u druhého 1,0:16,7 a u třetího 1,0:20,5. Klíčová slova:...
|
|
|
Umělé fosfolipidové membrány - metody přípravy, vlastnosti a využití
Hryzáková, Klára ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Sýkora, Michal (oponent)
Heterogenita biologických membrán vedla ke vzniku širokého spektra zjednodušených modelových systémů, jejichž uspořádání, velikost a tvar se dají přizpůsobovat různým požadavkům. Existují dva rozdílné přístupy k vytváření umělých fosfolipidových membrán. První z nich je založen na vzniku membrán ve vodném prostředí. Do této skupiny patří černé lipidové membrány, dvojvrstvy na pevném podkladu, dvojvrstvy vzniklé z monovrstev na rozhraní vody a vzduchu a dále liposomy. Ve druhém případě vznikají dvojvrstevné membrány v množství organické fáze tvorbou dvojvrstev na rozhraní kapiček. Každý typ umělých membrán má své experimentální výhody, což se používá ke studiu různých problémů sahajících od chování jednotlivých fosfolipidů a proteinů až po fúze membrán. Umělé fosfolipidové membrány jsou vhodným nástrojem pro elektrickou charakterizaci dvojvrstev nebo membránových proteinů. Tato práce je ucelený přehled nejpoužívanějších metod vhodných pro vznik umělých fosfolipidových membrán. Klíčová slova: membrána, lipid, fosfolipidová dvojvrstva, liposom, černá lipidová membrána, dvojvrstvy na pevném podkladu, dvojvrstva na rozhraní kapiček
|
host ::
RSS.