|
|
Studium řízení metabolismu karotenogenních kvasinek na molekulární úrovni
Pokrývková, Zuzana ; Kočí, Radka (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Predložená diplomová práca sa zaoberala molekulárnou charakterizáciou karotenogénnych kvasiniek. Použitými technikami pre analýzu konzervovaných úsekov rDNA D1/D2 oblasti veľkej ribozomálnej podjednotky 26S oblasti a ITS1 a 5,8-ITS2 oblastí boli „nested PCR“ a denaturačná gradientová elektroforéza DGGE. Z výsledkov DGGE vyplýva, že všetky analyzované kmene karotenogénnych kvasinek majú veľmi podobnú sekvenciu týchto oblastí, kvasinka Rhodotorula mucilaginosa so zbierkovým číslom CCY 20-7-28 preukazovala odlišnosti od ostatných kmeňov karotenogénnych kvasiniek. Pre doplnenie molekulárnej charakterizácie pomocou sekvencie ribozomálnych génov bola prevedená taktiež fenotypová charakterizácia celkom ôsmich kmeňov karotenogénnych kvasinek. K tomuto účelu boli prevedené utilizačné testy na rôznych substrátoch a ďalej rastové a produkčné charakteristky jednotlivých kmňov. Cieľom práce bolo taktiež pripraviť taký kmeň karotenogénnej kvasinky, ktorý sa vyznačuje nadprodukciou metabolitov, najmä karotenoidov a lipidov, a to pomocou náhodnej mutácie spôsobenej UV žiarením. Ako vhodný kandidát bol vybraný kmeň C. capitatum CCY 10-1-2 na základe predchádzajúcich štúdií, kde se preukázal ako dobrý producent TAG na odpadnom glycerole. Tento kmeň bol následne adaptovaný na odpadovú srvátku, glycerol a glukózu ako jednoduchý zdroj uhlíku.
|
|
|
Molecular Study of Intracellular Changes as Response of Microorganisms to Environment
Čarnecká, Martina ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
In nature yeast cells live in a rapidly changing environment. In order to survive constant fluctuations in their external surroundings cells quickly and effectively adapt their internal systems to meet the challenges of each new environment. One aspect of this cellular adaptation is the reorganization of genomic expression to the program required for growth in each environment. This genomic reorganization results in altered cell’s metabolome and physiology. The molecular responses elicited by the cells dictate whether the organism adapts, survives or, if injured beyond repair, undergoes death. In this work, genomic, proteomic and metabolic profiles of some carotenogenic yeasts grown in optimal and stress conditions were compared. To increase the yield of carotenoid pigments, several types of environmental changes as well as nutrition stress were applied. Yeasts were cultivated under osmotic, oxidative and metal stress, on different carbon sources or on various waste materials (whey, potato extract). Some chemical and UV mutants were also prepared and tested. Changes on yeast metabolome level were studied by RP-HPLC/MS technique used to carotenoid analysis. Another possibility to study stress response is preparation of transformed cells with deletion of definite genes. For setup, the method was first optimized for fission yeasts Schizosaccharomyces pombe. Technique is based on knockout constructs that contain regions homologous to the target gene cloned into vectors carrying dominant drug-resistance markers. As transformation vector plasmid pCloneKanmx confering resistance to geneticine was used. The vector and constructs were digested by relevant restriction endonucleases, ligated, amplified in E.coli and transformed into the yeast Schizosaccharomyces pombe sp286. Positive transformants were selected according to resistance to geneticine and checking PCR products. By analysis of transformants proteins required for meiotic chromosome segregation were identified.
|
|
|
Produkce vybraných kvasinkových metabolitů využitelných do potravinových doplňků
Němcová, Andrea ; Čertík, Milan (oponent) ; Vávrová, Milada (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Karotenoidy sú prirodzene sa vyskytujúce pigmenty rastlín, ktoré sú tiež produkované mnohými baktériami a hubami. Predstavujú jednu z najviac rozšírených skupín prírodných antioxidantov s významnými biologickými účinkami a mnohými priemyselnými aplikáciami. V tomto smere je zvýšený záujem o karotenoidy ako prirodzené antioxidanty, ktoré majú mimo iné schopnosť znižovať prejavy chronických ochorení, patologických stavov u ľudí a celkovo spomaľujú proces stárnutia. Používajú sa prevažne v potravinárskom priemysle, ale hojne sú využívané aj v chemickom, farmaceutickom či kozmetickom priemysle. Jednou z možností získavania týchto látok je využívanie potenciálu červených kvasiniek, ktoré sú schopné prevádzať rôzne substráty v karoténové pigmenty. V predloženej práci boli testované kvasinky patriace do rodov Rhodotorula, Sporobolomyces a Cystofilobasidium z hľadiska využívania vybraných odpadových substrátov. Boli tiež podrobené náhodnej mutagenéze za účelom zvýšenia produkcie biomasy a špecifických metabolitov – karotenoidov a iných lipidických látok. Ako alternatívne nutričné zdroje boli testované odpadové substráty z poľnohospodárskej a potravinárskej výroby (repka, ryža, pšeničné otruby, jablčná vláknina, cestoviny a lignocelulózové materiály). V niektorých produkčných médiách boli odpadové materiály hydrolyzované extracelulárnymi hydrolytickými enzýmami alebo komerčnými enzýmami za cieľom rozloženia komplexných sacharidických substrátov na jednoduché cukry utilizovateľné kvasinkami. Všetky testované kvasinkové kmene boli schopné využívať tieto odpadové materiály ako jediný zdroj uhlíka a zároveň produkovať pigmenty a obohatenú biomasu. V tejto práci bola študovaná charakterizácia karotenogénnych kvasiniek využitím molekulárnych techník. K tomuto účelu boli amplifikované medzidruhové konzervované sekvencie genómovej DNA, špeciálne oblasti rDNA D1/D2 ribozomálnej podjednotky a úseky ITS1 a 5,8-ITS2 rDNA. Tieto sekvencie boli podrobené analýze pomocou metódy DGGE k porovnaniu odlišností medzi jednotlivými karotenogénnymi kvasinkami. Technika izolácie intaktnej DNA bola optimalizovaná pre karyotypovú charakterizáciu kvasiniek metódou pulznej elektroforézy (PFGE). Jednotlivé karyotypy testovaných kvasiniek obsahovali viditeľné odlišnosti medzi kvasinkovými druhmi a rodmi.
|
|
|
Možnosti produkce pigmentů kvasinkami
Gonová, Dominika ; Hlaváček, Viliam (oponent) ; Němcová, Andrea (vedoucí práce)
Karotenoidy sú prirodzene sa vyskytujúce pigmenty syntetizované kvasinkami, baktériami, vláknitými hubami i rastlinami. V posledných rokoch vzrastá záujem o štúdium týchto pigmentov a ich mikrobiologickú produkciu najmä vďaka významným biologickým účinkom pripisovaným práve karotenoidom. Táto bakalárska práca je koncipovaná ako porovnávacia štúdia šiestich karotenogenných kvasiniek, a to dvoch kmeňov druhu Rhodotorula glutinis, Rhodotorula mucilaginosa, Sporobolomyces roseus, Sporobolomyces metaroseus a Sporobolomyces pararoseus. Ich kultivácia prebiehala na rôznych živných médiách, kde bol aplikovaný oxidačný stres v podobe peroxidu vodíka a tiež bol použitý odpadný materiál – vaječné cestoviny ako nutričný zdroj. Všetky študované kmene boli schopné využívať odpadný substrát ako zdroj živín, pričom u rodu Sporobolomyces boli na takomto médiu zaznamenané zvýšené produkcie sledovaných metabolitov. Pôsobením oxidačného stresu sa u väčšiny študovaných kvasiniek prejavili nadprodukcie karotenoidov i sprievodných lipidických látok. Kvasinka Sporobolomyces roseus CCY 19-6-4 sa pri kultivácii na cestovinovom médiu síce vyznačovala najvyššou produkciou karotenoidov (1923,78 µg/g -karoténu), ale na druhej strane sa u nej prejavil výrazný pokles biomasy. Ako potencionálne najlepší producent biomasy (9,85 g/l) i karotenoidov (780,24 µg/g -karoténu) sa ukázala kvasinka Rhodotorula glutinis CCY 20-2-26. Medzi prírodné pigmenty patrí aj pulcherimín syntetizovaný najmä kvasinkami, ale aj niektorými sporotvornými baktériami. V poslednej dobe sa intenzívne študuje jeho antagonistický efekt, ktorý vykazuje voči viacerým mikroorganizmom, čo sa javí ako veľmi významné z hľadiska biologickej kontroly. Druhá časť práce je venovaná práve štúdiu regulácie produkcie pulcherimínu a jeho antimikrobiálnej aktivite. Ako kvasinky produkujúce tento pigment boli použité kmene Metschnikowia pulcherrima 145, Metschnikowia pulcherrima 147, Mestchnikowia pulcherrima 149 a Metschnikowia andauensis 129, ktoré boli kultivované na rozličných živných médiách obsahujúcich rôzne koncentrácie iónov kovov a tiež peroxid vodíka ako exogénny stres. V rámci štúdia antagonistického efektu pulcherimínu boli ako testované mikroorganizmy využité grampozitívna baktéria Lactobacillus sakei, gramnegatívna baktéria Escherichia coli, ďalej kvasinka Candida glabrata a vláknitá pleseň Phanrochaete chrysosporium. Všetky kvasinky rodu Metschnikowia boli schopné produkcie pulcherimínu, a teda aj antagonistického efektu, iba v médiách obohatených o železité ióny, pričom intenzita sfarbenia bola priamo úmerná práve koncentrácii železa. Antimikrobiálna aktivita pulcherimínu sa neprejavila iba voči baktérií Escherichia coli.
|
|
|
Studium řízení metabolismu karotenogenních kvasinek na molekulární úrovni
Pokrývková, Zuzana ; Kočí, Radka (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Predložená diplomová práca sa zaoberala molekulárnou charakterizáciou karotenogénnych kvasiniek. Použitými technikami pre analýzu konzervovaných úsekov rDNA D1/D2 oblasti veľkej ribozomálnej podjednotky 26S oblasti a ITS1 a 5,8-ITS2 oblastí boli „nested PCR“ a denaturačná gradientová elektroforéza DGGE. Z výsledkov DGGE vyplýva, že všetky analyzované kmene karotenogénnych kvasinek majú veľmi podobnú sekvenciu týchto oblastí, kvasinka Rhodotorula mucilaginosa so zbierkovým číslom CCY 20-7-28 preukazovala odlišnosti od ostatných kmeňov karotenogénnych kvasiniek. Pre doplnenie molekulárnej charakterizácie pomocou sekvencie ribozomálnych génov bola prevedená taktiež fenotypová charakterizácia celkom ôsmich kmeňov karotenogénnych kvasinek. K tomuto účelu boli prevedené utilizačné testy na rôznych substrátoch a ďalej rastové a produkčné charakteristky jednotlivých kmňov. Cieľom práce bolo taktiež pripraviť taký kmeň karotenogénnej kvasinky, ktorý sa vyznačuje nadprodukciou metabolitov, najmä karotenoidov a lipidov, a to pomocou náhodnej mutácie spôsobenej UV žiarením. Ako vhodný kandidát bol vybraný kmeň C. capitatum CCY 10-1-2 na základe predchádzajúcich štúdií, kde se preukázal ako dobrý producent TAG na odpadnom glycerole. Tento kmeň bol následne adaptovaný na odpadovú srvátku, glycerol a glukózu ako jednoduchý zdroj uhlíku.
|
|
|
Možnosti produkce pigmentů kvasinkami
Gonová, Dominika ; Hlaváček, Viliam (oponent) ; Němcová, Andrea (vedoucí práce)
Karotenoidy sú prirodzene sa vyskytujúce pigmenty syntetizované kvasinkami, baktériami, vláknitými hubami i rastlinami. V posledných rokoch vzrastá záujem o štúdium týchto pigmentov a ich mikrobiologickú produkciu najmä vďaka významným biologickým účinkom pripisovaným práve karotenoidom. Táto bakalárska práca je koncipovaná ako porovnávacia štúdia šiestich karotenogenných kvasiniek, a to dvoch kmeňov druhu Rhodotorula glutinis, Rhodotorula mucilaginosa, Sporobolomyces roseus, Sporobolomyces metaroseus a Sporobolomyces pararoseus. Ich kultivácia prebiehala na rôznych živných médiách, kde bol aplikovaný oxidačný stres v podobe peroxidu vodíka a tiež bol použitý odpadný materiál – vaječné cestoviny ako nutričný zdroj. Všetky študované kmene boli schopné využívať odpadný substrát ako zdroj živín, pričom u rodu Sporobolomyces boli na takomto médiu zaznamenané zvýšené produkcie sledovaných metabolitov. Pôsobením oxidačného stresu sa u väčšiny študovaných kvasiniek prejavili nadprodukcie karotenoidov i sprievodných lipidických látok. Kvasinka Sporobolomyces roseus CCY 19-6-4 sa pri kultivácii na cestovinovom médiu síce vyznačovala najvyššou produkciou karotenoidov (1923,78 µg/g -karoténu), ale na druhej strane sa u nej prejavil výrazný pokles biomasy. Ako potencionálne najlepší producent biomasy (9,85 g/l) i karotenoidov (780,24 µg/g -karoténu) sa ukázala kvasinka Rhodotorula glutinis CCY 20-2-26. Medzi prírodné pigmenty patrí aj pulcherimín syntetizovaný najmä kvasinkami, ale aj niektorými sporotvornými baktériami. V poslednej dobe sa intenzívne študuje jeho antagonistický efekt, ktorý vykazuje voči viacerým mikroorganizmom, čo sa javí ako veľmi významné z hľadiska biologickej kontroly. Druhá časť práce je venovaná práve štúdiu regulácie produkcie pulcherimínu a jeho antimikrobiálnej aktivite. Ako kvasinky produkujúce tento pigment boli použité kmene Metschnikowia pulcherrima 145, Metschnikowia pulcherrima 147, Mestchnikowia pulcherrima 149 a Metschnikowia andauensis 129, ktoré boli kultivované na rozličných živných médiách obsahujúcich rôzne koncentrácie iónov kovov a tiež peroxid vodíka ako exogénny stres. V rámci štúdia antagonistického efektu pulcherimínu boli ako testované mikroorganizmy využité grampozitívna baktéria Lactobacillus sakei, gramnegatívna baktéria Escherichia coli, ďalej kvasinka Candida glabrata a vláknitá pleseň Phanrochaete chrysosporium. Všetky kvasinky rodu Metschnikowia boli schopné produkcie pulcherimínu, a teda aj antagonistického efektu, iba v médiách obohatených o železité ióny, pričom intenzita sfarbenia bola priamo úmerná práve koncentrácii železa. Antimikrobiálna aktivita pulcherimínu sa neprejavila iba voči baktérií Escherichia coli.
|
|
|
Produkce vybraných kvasinkových metabolitů využitelných do potravinových doplňků
Němcová, Andrea ; Čertík, Milan (oponent) ; Vávrová, Milada (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Karotenoidy sú prirodzene sa vyskytujúce pigmenty rastlín, ktoré sú tiež produkované mnohými baktériami a hubami. Predstavujú jednu z najviac rozšírených skupín prírodných antioxidantov s významnými biologickými účinkami a mnohými priemyselnými aplikáciami. V tomto smere je zvýšený záujem o karotenoidy ako prirodzené antioxidanty, ktoré majú mimo iné schopnosť znižovať prejavy chronických ochorení, patologických stavov u ľudí a celkovo spomaľujú proces stárnutia. Používajú sa prevažne v potravinárskom priemysle, ale hojne sú využívané aj v chemickom, farmaceutickom či kozmetickom priemysle. Jednou z možností získavania týchto látok je využívanie potenciálu červených kvasiniek, ktoré sú schopné prevádzať rôzne substráty v karoténové pigmenty. V predloženej práci boli testované kvasinky patriace do rodov Rhodotorula, Sporobolomyces a Cystofilobasidium z hľadiska využívania vybraných odpadových substrátov. Boli tiež podrobené náhodnej mutagenéze za účelom zvýšenia produkcie biomasy a špecifických metabolitov – karotenoidov a iných lipidických látok. Ako alternatívne nutričné zdroje boli testované odpadové substráty z poľnohospodárskej a potravinárskej výroby (repka, ryža, pšeničné otruby, jablčná vláknina, cestoviny a lignocelulózové materiály). V niektorých produkčných médiách boli odpadové materiály hydrolyzované extracelulárnymi hydrolytickými enzýmami alebo komerčnými enzýmami za cieľom rozloženia komplexných sacharidických substrátov na jednoduché cukry utilizovateľné kvasinkami. Všetky testované kvasinkové kmene boli schopné využívať tieto odpadové materiály ako jediný zdroj uhlíka a zároveň produkovať pigmenty a obohatenú biomasu. V tejto práci bola študovaná charakterizácia karotenogénnych kvasiniek využitím molekulárnych techník. K tomuto účelu boli amplifikované medzidruhové konzervované sekvencie genómovej DNA, špeciálne oblasti rDNA D1/D2 ribozomálnej podjednotky a úseky ITS1 a 5,8-ITS2 rDNA. Tieto sekvencie boli podrobené analýze pomocou metódy DGGE k porovnaniu odlišností medzi jednotlivými karotenogénnymi kvasinkami. Technika izolácie intaktnej DNA bola optimalizovaná pre karyotypovú charakterizáciu kvasiniek metódou pulznej elektroforézy (PFGE). Jednotlivé karyotypy testovaných kvasiniek obsahovali viditeľné odlišnosti medzi kvasinkovými druhmi a rodmi.
|
|
|
Molecular Study of Intracellular Changes as Response of Microorganisms to Environment
Čarnecká, Martina ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
In nature yeast cells live in a rapidly changing environment. In order to survive constant fluctuations in their external surroundings cells quickly and effectively adapt their internal systems to meet the challenges of each new environment. One aspect of this cellular adaptation is the reorganization of genomic expression to the program required for growth in each environment. This genomic reorganization results in altered cell’s metabolome and physiology. The molecular responses elicited by the cells dictate whether the organism adapts, survives or, if injured beyond repair, undergoes death. In this work, genomic, proteomic and metabolic profiles of some carotenogenic yeasts grown in optimal and stress conditions were compared. To increase the yield of carotenoid pigments, several types of environmental changes as well as nutrition stress were applied. Yeasts were cultivated under osmotic, oxidative and metal stress, on different carbon sources or on various waste materials (whey, potato extract). Some chemical and UV mutants were also prepared and tested. Changes on yeast metabolome level were studied by RP-HPLC/MS technique used to carotenoid analysis. Another possibility to study stress response is preparation of transformed cells with deletion of definite genes. For setup, the method was first optimized for fission yeasts Schizosaccharomyces pombe. Technique is based on knockout constructs that contain regions homologous to the target gene cloned into vectors carrying dominant drug-resistance markers. As transformation vector plasmid pCloneKanmx confering resistance to geneticine was used. The vector and constructs were digested by relevant restriction endonucleases, ligated, amplified in E.coli and transformed into the yeast Schizosaccharomyces pombe sp286. Positive transformants were selected according to resistance to geneticine and checking PCR products. By analysis of transformants proteins required for meiotic chromosome segregation were identified.
|
host ::
RSS.