|
|
Utilization of pulse labelling techniques for studying the dynamics of proteins and protein complexes
Polák, Marek ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Vrbacký, Marek (oponent)
(In Czech) Hmotnostní spektrometrie (MS) se stala častou technikou pro sledování struktury a dynamiky proteinů a proteinových komplexů. I když techniky založené na MS detekci nemohou poskytovat informace s vysokým rozlišením, jako je např. rentgenová difrakce, nukleární magnetická rezonance (NMR), nebo kryo-elektronová mikroskopie (cryo-EM), jsou dobrým nástrojem z hlediska poskytování informaci ohledně dynamiky, struktury a interakcí analytů s dalšími molekulami, např. ligandy. Tato doktorská práce představuje přínos do oblasti strukturní biologie při využití kovalentního značení, tzv. rychlé fotochemické oxidace proteinů (FPOP) a oxidace singletním kyslíkem (1 O2) pro studium struktury, dynamiky a interakcí proteinů a proteinových komplexů s dvoušroubovici DNA.V první části práce byla metoda FPOP využita k studiu struktury komplexu FOXO4-DAF16, která poukázala na možnosti analýzy takového komplexu pomocí přístupů "bottom-up" a "top-down". Dále je zde představena strategie izotopové deplece pro strategii "top- down", kde je demonstrována její výhoda ve spojení s multiCASI-ECD za účelem získaní nejvyšší možné strukturní informace ohledně interakce FOXO4 s IRE. Studie ukazuje, jak mohou informace získané ze strukturní proteomiky vést k vytvoření in-silico modelů protein-DNA komplexů, jejichž...
|
|
|
Mass spectrometry in structural proteomics: study of viral protein complexes
RAVI, Anirudhan
This thesis investigated the avian reovirus sigma NS protein and its interaction with RNA using mass spectrometric methods. The sigma NS structure is still not known; thus, hydrogen-deuterium exchange and cross-linking coupled to mass spectrometry were employed to understand protein conformation. This research provides insights into protein-RNA interactions and the obtained data will be used in future work to predict protein structure.
|
|
|
Strukturní charakterizace modelového zástupce hemových kyslíkových senzorů
Tajovská, Eva ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Jednou z podskupin hemoproteinů jsou hemové senzory plynů, které jsou schopny detekovat dvouatomové plynné molekuly ve svém bezprostředním okolí. Po navázání molekuly plynu na atom železa hemu v senzorové doméně těchto proteinů nebo naopak po její disociaci z tohoto atomu dochází k přenosu signálu ze senzorové domény do domény funkční a následně k regulaci důležitých buněčných funkcí. Pochopení mechanismu působení těchto senzorů je klíčové pro případné ovlivnění jejich funkce. Taková znalost by pak následně umožnila využití senzorů plynů jako terapeutických cílů pro vývoj antibiotik nové generace, pokud vezmeme v úvahu jejich přítomnost v patologických bakteriích. Předkládaná diplomová práce se zabývá modelovým zástupcem senzorových hemoproteinů detekujících plyny, kyslíkovým senzorem EcDOS z E. coli, a jeho apoformou, EcDOS His77Ala. Oba proteiny byly připraveny rekombinantní expresí a purifikací a následně spektrofotometricky charakterizovány. Pomocí gelové permeační chromatografie byl stanoven oligomerní stav EcDOS Fe(III), EcDOS Fe(II)-O2 a EcDOS His77Ala za různých podmínek (různé způsoby temperování preparátu, přítomnost substrátu c-di-GMP atd.). Dále byla studována strukturní dynamika EcDOS Fe(III), EcDOS Fe(II)-O2 a EcDOS His77Ala pomocí metody HDX-MS. Klíčová slova: hem, hemové senzorové...
|
|
|
Studium vlivu kofaktoru na strukturu proteinu pomocí hmotnostní spektrometrie
Rosůlek, Michal ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Bakteriální protein WrbA z E. coli je zakládajícím členem nové rodiny FMN dependentních NAD(P)H oxidoreduktas, tvořící funkční i strukturní vývojový stupeň mezi bakteriálními flavodoxiny a některými savčími NAD(P)H:chinon oxidoreduktasami. Z těchto důvodů je protein WrbA v poslední době intenzivně studován pomocí různých analytických metod i počítačových simulací. Protein WrbA participuje na ochraně buněk před oxidativním stresem, přesná funkce proteinu WrbA in vivo je však stále neznámá. Protein WrbA tvoří v roztocích multimery, v μM koncentracích se při nízkých teplotách (4 řC) nachází ve formě dimeru, s rostoucí teplotou tetramerizuje. Dostupné trojrozměrné krystalové struktury obsahují informace pouze o tetramerní formě proteinu, dimerní forma dosud nebyla strukturně charakterizována. Tato práce byla zaměřena na studium dynamického chování proteinu v roztoku metodami vodík-deuteriové výměny a chemického síťování s následnou analýzou hmotnostním spektrometrem s vysokým rozlišením (FT-ICR). Sledováno bylo chování proteinu v závislosti na vazbě kofaktoru FMN nebo změnách teploty a koncentrace. Analýzou dat z vodík-deuteriové výměny byly získány informace o přístupnosti rozpouštědla a dynamice pro kompletní sekvenci proteinu. Popsán byl stabilizační vliv kofaktoru na tetramerní strukturu proteinu,...
|
|
|
Structural characterization of interaction between transcription factors and DNA
Filandrová, Růžena ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Vondrášek, Jiří (oponent) ; Wimmerová, Michaela (oponent)
Strukturní charakterizace interakce transkripčních faktorů s DNA Mgr. Růžena Filandrová Abstrakt Transkripční faktory jsou proteiny, které regulují expresi genů skrze svou interakci s DNA a dalšími faktory. Tím buňce umožňují reagovat na různé vnitřní i vnější podněty a hrají proto důležitou roli v mnoha buněčných dějích jako je například regulace buněčného cyklu, diferenciace buněk během vývoje organismu nebo imunitní reakce. K pochopení těchto dějů je nezbytná nejen znalost 3D struktury samotných transkripčních faktorů, ale i mechanismů jejich vazby na DNA. Nicméně, některé typické vlastnosti transkripčních faktorů, jako je například přítomnost nestrukturovaných oblastí, způsobují, že je velmi obtížné určovat jejich 3D strukturu klasickými metodami s vysokým rozlišením. Z těchto důvodů mohou být pro popis struktury komplexů transkripčních faktorů s DNA s výhodou využity metody s nižším rozlišením, jako je například strukturní hmotnostní spektrometrie, která byla použita v této práci. V první části této práce byl nejprve optimalizován soubor metod strukturní hmotnostní spektrometrie se zaměřením hlavně na optimalizaci podmínek vodík/deuteriové výměny (HDX-MS) pro jejich využití k analýze komplexů transkripčních faktorů s DNA. Následně pak byly pomocí těchto metod charakterizovány dva komplexy...
|
|
|
Studium vlivu kofaktoru na strukturu proteinu pomocí hmotnostní spektrometrie
Rosůlek, Michal ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Bakteriální protein WrbA z E. coli je zakládajícím členem nové rodiny FMN dependentních NAD(P)H oxidoreduktas, tvořící funkční i strukturní vývojový stupeň mezi bakteriálními flavodoxiny a některými savčími NAD(P)H:chinon oxidoreduktasami. Z těchto důvodů je protein WrbA v poslední době intenzivně studován pomocí různých analytických metod i počítačových simulací. Protein WrbA participuje na ochraně buněk před oxidativním stresem, přesná funkce proteinu WrbA in vivo je však stále neznámá. Protein WrbA tvoří v roztocích multimery, v μM koncentracích se při nízkých teplotách (4 řC) nachází ve formě dimeru, s rostoucí teplotou tetramerizuje. Dostupné trojrozměrné krystalové struktury obsahují informace pouze o tetramerní formě proteinu, dimerní forma dosud nebyla strukturně charakterizována. Tato práce byla zaměřena na studium dynamického chování proteinu v roztoku metodami vodík-deuteriové výměny a chemického síťování s následnou analýzou hmotnostním spektrometrem s vysokým rozlišením (FT-ICR). Sledováno bylo chování proteinu v závislosti na vazbě kofaktoru FMN nebo změnách teploty a koncentrace. Analýzou dat z vodík-deuteriové výměny byly získány informace o přístupnosti rozpouštědla a dynamice pro kompletní sekvenci proteinu. Popsán byl stabilizační vliv kofaktoru na tetramerní strukturu proteinu,...
|
host ::
RSS.