|
|
Moderní metody studia protein-proteinových interakcí
Křivková, Jana ; Hrdý, Ivan (vedoucí práce) ; Kučerová, Jitka (oponent)
Protein-proteinové interakce (PPI) hrají nepostradatelnou roli ve všech procesech v živých buňkách. Pochopení interakcí mezi proteiny nám umožňuje bližší popis buněčných dějů a jejich pochopení otevírá nové možnosti i pro návrh léčiv. Důležitost otázky studia PPI se odráží v recentním rozvoji různorodých metod pro jejich identifikaci a popis. Cílem této práce je sumarizovat poznatky o nových a zdokonalených experimentálních metodách identifikace a charakterizace proteinových interakcí. Metody popsané v této práci jsou členěny do čtyř kapitol, metody blízkostí indukovaného značení proteinů (BioID, BioID2, APEX, TurboID, MiniTurbo, PUP-IT, AirID, SPPLAT, EMARS), využití síťování proteinů pro jejich identifikaci a strukturní charakterizaci (XL-MS), fluorescenční metody identifikace a vizualizace (BiFC, FRET, BRET) a biofyzikální metody pro stanovení kinetických či termodynamických parametrů interakce (SPR, ITC, MT).
|
|
|
Purifikace rekombinantních proteinů pomocí afinitní chromatografie
Zemek, Ondřej ; Mácha, Jaroslav (vedoucí práce) ; Hrdý, Ivan (oponent)
Izolace a purifikace rekombinantních proteinů je základním předpokladem pro studium jejich strukturních a funkčních vlastností. Mezi nejdůležitější metody, které jsou k tomuto účelu využívány patří afinitní chromatografie. V této práci jsou shrnuty v literatuře publikované vlastnosti a zkušenosti s využitím nejpoužívanějších afinitních tagů. Zde probrané tagy zahrnují:CBP, MBP, GST, polyhistidinové a polyargininové tagy, FLAG-tag, Strep-tag II a SpA a některé jejich modifikace. U jednotlivých tagů je probrán jejich původ a vlastnosti, vliv na formu a lokalizaci fúzního proteinu, způsob jeho vazby a eluce ze substrátu a možnosti jeho odstranění nebo využití v jiných metodách. Klíčová slova: afinitní chromatografie, rekombinantní protein, purifikace, afinitní tag
|
|
|
Stanovení pepsinogenů za použití IgY a IgG
Kulhavá, Lucie ; Pacáková, Věra (vedoucí práce) ; Tichá, Marie (oponent)
Snížení koncentrace pepsinogenu A v krevním séru je důležitým markerem rakoviny žaludku, stejně jako nižší poměr pepsinogenu A a pepsinogenu C. V této práci byly porovnány vlastnosti imunoglobulinových frakcí izolovaných z vaječných žloutků po imunizaci slepic pepsinogem, který byl izolován z vepřové žaludeční sliznice, a králičího séra získaného po imunizaci stejným antigenem. Charakteristika a srovnání slepičích a králičích protilátek bylo prováděno za použití metod: ELISA, afinitní chromatografie s imobilizovaným antigenem a hovězím sérovým albuminem, SDS a nativní elektroforézou a MALDI-TOF MS/MS. Specifické králičí protilátky měly značnou afinitu k antigenu a nízkou afinitu k hovězímu sérovému albuminu, a poskytovaly rozdíl mezi pre-imunní IgG a specifickou IgG, což u slepičích protilátek nebylo pozorováno. V případě slepičích protilátek nebyly pozorovány žádné rozdíly mezi pre-imunní IgY a specifickou IgY proti vepřovému pepsinogenu, a dále byla zjištěna výrazná afinita k hovězímu sérovému albuminu u pre-imunní IgY i u specifické IgY proti vepřovému pepsinogenu. Podobné výsledky byly získány i v experimentech, kdy byl použit lidský pepsinogen A a lidský pepsinogen C. Klíčová slova: Pepsinogeny, ELISA, afinitní chromatografie, protilátky
|
|
|
Stanovení pepsinogenů za použití IgY a IgG
Kulhavá, Lucie ; Pacáková, Věra (vedoucí práce) ; Tichá, Marie (oponent)
Snížení koncentrace pepsinogenu A v krevním séru je důležitým markerem rakoviny žaludku, stejně jako nižší poměr pepsinogenu A a pepsinogenu C. V této práci byly porovnány vlastnosti imunoglobulinových frakcí izolovaných z vaječných žloutků po imunizaci slepic pepsinogem, který byl izolován z vepřové žaludeční sliznice, a králičího séra získaného po imunizaci stejným antigenem. Charakteristika a srovnání slepičích a králičích protilátek bylo prováděno za použití metod: ELISA, afinitní chromatografie s imobilizovaným antigenem a hovězím sérovým albuminem, SDS a nativní elektroforézou a MALDI-TOF MS/MS. Specifické králičí protilátky měly značnou afinitu k antigenu a nízkou afinitu k hovězímu sérovému albuminu, a poskytovaly rozdíl mezi pre-imunní IgG a specifickou IgG, což u slepičích protilátek nebylo pozorováno. V případě slepičích protilátek nebyly pozorovány žádné rozdíly mezi pre-imunní IgY a specifickou IgY proti vepřovému pepsinogenu, a dále byla zjištěna výrazná afinita k hovězímu sérovému albuminu u pre-imunní IgY i u specifické IgY proti vepřovému pepsinogenu. Podobné výsledky byly získány i v experimentech, kdy byl použit lidský pepsinogen A a lidský pepsinogen C. Klíčová slova: Pepsinogeny, ELISA, afinitní chromatografie, protilátky
|
|
|
Izolace proteinů z oviduktální tekutiny prasnice afinitní chromatografií na DNA-celulose
Černá, Tereza ; Liberda, Jiří (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Oviduktální tekutina byla izolována z vejcovodů prasnice, tekutina byla zmražena a lyofilizována pro následnou chromatografickou separaci na DNA-celulose a pro stanovení antimikrobiální a glykosidasové aktivity. Afinitní chromatografií na DNA-celulose byly separovány dvě frakce - proteklá a vázající. SDS-elektroforézou byly detekovány čtyři zóny - tři zóny o relativních molekulových hmotnostech 15 000 - 21 000, odpovídající relativní molekulovou hmotností histonům, a čtvrtá zóna o ~ 34 000. Tyto zóny jsou odeslány na identifikaci pomocí analýzy MALDI-TOF. Byla prokázána antimikrobiální aktivita ve frakci izolované na DNA-celulose, a to ve frakci, která se nevázala; a v celkové oviduktální tekutině. Ve vázající frakci nebyla sledována antimikrobiální aktivita, neboť afinitní chromatografie neposkytla dostatečné množství proteinů pro relevantní stanovení. Byla potvrzena přítomnost glykosidasové aktivity v celkové oviduktální tekutině.
|
|
|
Purifikace rekombinantních proteinů pomocí afinitní chromatografie
Zemek, Ondřej ; Mácha, Jaroslav (vedoucí práce) ; Hrdý, Ivan (oponent)
Izolace a purifikace rekombinantních proteinů je základním předpokladem pro studium jejich strukturních a funkčních vlastností. Mezi nejdůležitější metody, které jsou k tomuto účelu využívány patří afinitní chromatografie. V této práci jsou shrnuty v literatuře publikované vlastnosti a zkušenosti s využitím nejpoužívanějších afinitních tagů. Zde probrané tagy zahrnují:CBP, MBP, GST, polyhistidinové a polyargininové tagy, FLAG-tag, Strep-tag II a SpA a některé jejich modifikace. U jednotlivých tagů je probrán jejich původ a vlastnosti, vliv na formu a lokalizaci fúzního proteinu, způsob jeho vazby a eluce ze substrátu a možnosti jeho odstranění nebo využití v jiných metodách. Klíčová slova: afinitní chromatografie, rekombinantní protein, purifikace, afinitní tag
|
|
| |
|
|
Analýza glykoproteinů ze slinných žláz klíštěte \kur{Ixodes ricinus}
BUČINSKÁ, Lenka
Charakterizovala jsem nekolik potencionálních glykoproteinů z extraktů slinných žláz nenasátých a částečně nasátých samic klíštěte Ixodes ricinus použitím afinitního značení s lektiny a pomocí enzymatické deglykosylační reakce. Izolovala jsem glykoprotein specifický k lektinu GNA. Tento glykoprotein obsahuje N{--}vázanou terminální manózu připojenou Man{$\alpha$}1,3Man. Tento protein byl hmotnostní spektrometrii určen jako Karboxypeptidáza M. Dále byly izolovány dva glykoproteiny obsahující GalNAc pomocí HPA{--}afinitní chromatografie. Výsledkem MS analýzy bylo určení morčecího proteinu Trappin 12. V SŽ nasáté samice klíštěte jsem detekovala fukózu vazanou vazbami {$\alpha$}1,2, {$\alpha$}1,3 a {$\alpha$}1,6. Také přítomnost O{--}vázané fukózy je možná. Přítomnost kyseliny sialové v glykoproteinech SŽ a slinách nasáté samice klíště byla nepřímo prokázána vazbou s MAA II lektinem. Analýzou hmotnostní spekrometrie byla zjištěna N{--}terminální sekvence peptidu podobná s myším sialoadhesinem (Siglec 1). Dosavadní výsledky z MS zatím nepřispěly k potvrzení či vyvrácení přítomnosti Siglec 1. Z nenasátých SŽ samic jsme izolovali dva proteiny specifické pro značení GNA lektinem. Byly předběžně identifikovány jako protein podobný arylsulfatáze B a Sojo protein cytoskeletu klíštěte Ixodes. Přítomnost proteinů s GNA specifitou byla prokázána v granulech acinů SŽ nenasáté a částečně nasáté samice klíštěte. Přítomnost fukózy byla prokázána v granulárních buňkách acinů II a III a ve střevních buňkách a obsahu střeva klíštěte pomocí afinitního značení a reakce byla pozorována florescenčním mikroskopem.
|
|
| |
|
| |
host ::
RSS.