|
|
Genome editing using programmable endonucleases
Hanečková, Radmila ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Sýkora, Michal (oponent)
Programovatelné endonukleázy jsou proteiny schopné rozpoznat specifické sekvence nukleotidů a následně v rozpoznané sekvenci štěpit obě vlákna DNA. Zinc-finger nukleázy jsou široce využívaným nástrojem v genomové editaci, metodě zavádění změn do genomů buněčných liní nebo celých organismů za účelem studia funkce genů. Nedávno se objevily nové typy programovatelných endonukleáz v podobě transcription activator-like effector (TALE) nukleáz a CRISPR/Cas systému. Tyto systémy se od sebe liší z pohledu mechanizmu funkce, dostupnosti, selektivity, frekvence off- targetů a cytotoxicity. V této práci zinc-finger nukleázy, TALE nukleázy a CRISPR/Cas systém porovnáváme a zkoumáme jejich aktuální a možné budoucí využití v široké oblasti výzkumu, který sahá od vývoje geneticky modifikovaných organismů až po genovou terapii. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Generation and Characterization of Glutamate Carboxypeptidase II (GCPII)-Deficient Mice
Vorlová, Barbora ; Šácha, Pavel (vedoucí práce) ; Eckschlager, Tomáš (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII) je transmembránový glykoprotein skládající se z krátké intracelulární a transmembránové domény a velké extracelulární domény, která vykazuje karboxypeptidasovou aktivitu. GCPII se podílí na neuromodulaci v mozku a absorpci folátů v tenkém střevě. Kromě těchto tkání se GCPII též vyskytuje v prostatě a ledvinách. Zde je ale její role neznámá. Za účelem zjištění funkce GCPII se několik vědeckých skupin pokusilo inaktivovat gen Folh1 (kódující GCPII) v myši. Tyto experimenty však vedly k rozporuplným výsledkům. Zatímco dvě studie ukázaly, že inaktivace genu Folh1 v myši vede k embryonální letalitě, jiné dvě studie publikovaly, že i po zmíněné inaktivaci jsou myši stále viabilní a navíc nevykazují žádný výrazný fenotyp. Cílem tohoto projektu bylo pokusit se připravit a charakterizovat myši s inaktivovaným Folh1 genem pomocí alternativní metody genetické modifikace. Za tímto účelem byly vytvořeny TALENy, které specificky cílily 11. exon genu Folh1 v myších zygotách genetického pozadí C57BL/6NCrl. Narozená mláďata generace F0 byla analyzována pro přítomnost mutací v rámci genu Folh1 a myši, které dohromady nesly 5 různých delecí, byly vybrány pro vytvoření mutantních linií. Linie, které nesly mutantní varianty genu Folh1 na obou alelách, neobsahovaly detekovatelnou...
|
|
|
Programmable nucleases in human therapy
Šlaufová, Marta ; Kašpárek, Petr (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Většina genomických mutací vede k závažným symptomům, které obvykle nejsou vyléčitelné. Intenzivní vývoj technik spojených s programovatelnými nukleázami (PN) v posledních letech otevřel nové možnosti při léčbě mnoha nemocí, jako jsou například geneticky podmíněné choroby, infekční nemoci, nebo rakovina. PN jsou enzymy, které umožňují místně specifické štěpení DNA, jež může vést k cílené modifikaci daného genomického lokusu. Skládají se z domény nespecificky štěpící DNA a z DNA-vazebné domény, která má buď formu modulárních proteinů vázajících se na DNA, nebo formu oligonukleotidů, které se na základě "Watson-Crickovského" párování váží na odpovídající sekvenci DNA. Doména nespecificky štěpící DNA zajišťuje vznik dvouvláknových zlomů, které jsou nezbytné pro následující úpravy genomu. Vývoj zinc finger nukleáz (ZFN) a poté i TALE nukleáz (transcription activator-like effector nucleases, TALEN) umožnil první terapeutické postupy založené na cílené úpravě lidského genomu. Technologie CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) přinesla další výrazné zjednodušení a rozšíření metod využívajících PN. Tato práce si klade za cíl poskytnout přehled o současném stavu, vývoji a překážkách v oblasti využití PN při léčbě lidských pacientů.
|
|
| |
|
|
Generation and analysis of double deficient transgenic mice for kallikrein-related peptidase 5 and kallikrein-related peptidase 14
Hanečková, Radmila ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Fulková, Helena (oponent)
Peptidázy příbuzné kalikreinu (KLK) představují vysoce konzervovanou rodinu serinových pro- teáz. In vitro experimenty naznačují, že KLK peptidázy hrají důležitou roli v řadě fyziologických a patofyziologických procesů. Jejich úloha in vivo ovšem zůstává ne zcela probádaná, částečně i kvůli nedostatku vhodných zvířecích modelů. Cílem této práce je příprava myšího modelu dvojnásobně deficientního na KLK5 a KLK14. Předpokládá se, že KLK5 a KLK14 jsou součástí proteolytických sítí v pokožce, které jsou významné pro udržení homeostáze kůže. Ovšem myší modely deficientní pouze na KLK5 nebo KLK14 vykazují jenom minimální či žádný fenotyp, pravděpodobně kvůli vzájemné funkční kompenzaci na základě podobné substrátové specifity. V této práci popisujeme úspěšné vytvoření myši dvojnásobně deficientní na KLK5 a KLK14. Dvojnásobně deficientní myši nelze snadno získat křížením kvůli přítomnosti genů pro Klk5 a Klk14 ve stejném lokusu na chromozomu 7, proto k tvorbě myšího modelu používáme TAL efektor nukleázy (TALENy) cílené na Klk14, které aplikujeme mikroinjekcí TALENové mRNA do KLK5-deficientních zygot. Dále ukazujeme, že myši dvojnásobně deficientní na KLK5 a KLK14 jsou životaschopné a plodné. Domníváme se, že tyto nové myší modely mohou sloužit jako užitečný experimentální nástroj ke studiu KLK5 a KLK14 in vivo.
|
|
|
Function and regulation of ETV4 and MSX1 transcription factors in colon cancer progression
Hrčkulák, Dušan ; Kříž, Vítězslav (vedoucí práce) ; Libusová, Lenka (oponent)
Rakovina tlustého střeva je jedním z nejčastěji diagnostikovaných nádorových onemocnění moderního světa a způsobí přibližně sedm procent všech úmrtí spojených s nádorovým bujením. Vzhledem k nízké účinnosti tradiční léčby je nutné se intenzivně zabývat molekulárními mechanismy vzniku tohoto onemocnění. Kanonická signální dráha ligandů Wnt je za fyziologických podmínek zásadní pro obnovu střevního epitelu, ale její přílišná aktivace vede ke vzniku nádorů. Přestože je tato signální dráha předmětem podrobného studia, její vliv a následný přenos signálu není ještě dokonale objasněn. Jako model pro výzkum nádorového bujení způsobeného nefyziologickou signalizací ligandů Wnt používáme myší kmen nesoucí mutovanou verzi proteinu APC, který v této signalizaci působí jako nádorový supresor. Předběžná expresní analýza nádorových buněk ze střeva zmiňované myši odhalila významné zvýšení exprese u dvou transkripčních faktorů: ETV4 a MSX1. V tomto projektu se snažíme potvrdit, že jsou tyto proteiny závislé na kanonické signalizaci ligandů Wnt a důležité pro rozvoj rakoviny tlustého střeva. Zkoumáme jejich regulaci a funkci pomocí luciferázových reportérů, qRT-PCR, imunohistochemie, in situ hybridizace, knockdown a knockout experimentů. Funkční studie provádíme také na buněčných liniích odvozených od kolorektálních...
|
|
|
Genome editing using programmable endonucleases
Hanečková, Radmila ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Sýkora, Michal (oponent)
Programovatelné endonukleázy jsou proteiny schopné rozpoznat specifické sekvence nukleotidů a následně v rozpoznané sekvenci štěpit obě vlákna DNA. Zinc-finger nukleázy jsou široce využívaným nástrojem v genomové editaci, metodě zavádění změn do genomů buněčných liní nebo celých organismů za účelem studia funkce genů. Nedávno se objevily nové typy programovatelných endonukleáz v podobě transcription activator-like effector (TALE) nukleáz a CRISPR/Cas systému. Tyto systémy se od sebe liší z pohledu mechanizmu funkce, dostupnosti, selektivity, frekvence off- targetů a cytotoxicity. V této práci zinc-finger nukleázy, TALE nukleázy a CRISPR/Cas systém porovnáváme a zkoumáme jejich aktuální a možné budoucí využití v široké oblasti výzkumu, který sahá od vývoje geneticky modifikovaných organismů až po genovou terapii. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
TAL Effectors: Tools for DNA Targeting
Jankele, Radek ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Přes dvacet let trvající výzkum interakcí fytopatogenních bakterií rodu Xanthomonas s jejich hostiteli vyústil objevem nové proteinové rodiny nazvané Transcription Activator like (TAL) efektory. TAL efektory jsou hlavní faktory virulence umožňující rozmnožování a následné šíření bakterií změnami genové exprese rostlinných buněk. TAL efektory rozpoznávají prostřednictvím struktury jejich DNA-vazebné domény specifické sekvence v promotorech hostitelských genů, jejichž transkripci následně aktivují. DNA-vazebná doména obsahuje krátké repetitivní peptidové moduly, které obtáčejí dvouvláknovou DNA a vytvářejí tak unikátní strukturní motiv. Jednotlivé moduly rozpoznávají po sobě jdoucí nukleotidy v cílové sekvenci prostřednictvím jedné ze dvou polymorfních aminokyselin ve smyčce kontaktující velký žlábek DNA. Dvojce těchto aminokyselin určují rozpoznávané nukleotidy takto: NI > A, HD > C, NH > G, NG > T a NN > A nebo G. Tento jednoduchý kód umožňuje přípravu umělých TAL DNA-vazebných domén s požadovanou sekvenční specifitou během jednoho týdne s minimálními náklady. Umělé TAL domény spojené s nukleázovou nebo aktivační doménou nacházejí uplatnění ve výzkumu, biotechnologii a genové terapii pro cílené genové modifikace a pro regulaci genové exprese. TAL efektor nukleázy (TALENy) umožňují provádět cílené genové...
|
|
|
Cílená mutageneze endogenního genu v genomu \kur{D. melanogaster} programovatelnými nukleázami
RENNER, Marek
Several techniques have recently been described for precise mutagenesis of selected target sites in the genome. This thesis establishes the method of gene targeting by CRISPR/Cas system in D. melanogaster and compares it with gene targeting using TALENs. To test the mutagenesis systems, we choose an endogenous gene encoding concentrative nucleoside transporter gene (CNT1). We have received two mutants containing large deletions affecting the N-terminal part of the CNT1 gene. We show that CRISPR/Cas is useful tool for targeted gene disruption in D. melanogaster.
|
host ::
RSS.