|
|
Netradiční funkce forminů mimo nukleaci aktinu
Metlička, Jáchym ; Cvrčková, Fatima (vedoucí práce) ; Opatrný, Zdeněk (oponent)
Od objevu v roce 1990 byly proteiny s Formin homology 2 (FH2) doménou (forminy) pozorovány ve všech analyzovaných druzích spadajících pod eukaryota. Znalost struktury a funkce FH2 domény se za posledních několik let výrazně zlepšila. Její schopnosti nukleace, polymerace a procesivního cappingu aktinových filament činí z proteinů forminové rodiny významné faktory ovlivňující podobu cytoskeletu. Ale FH2 doména tvoří pouze dílek skládanky další volitelné konzervované peptidické struktury, které ji obklopují, stejně jako konkrétní podoba samotné FH2 domény, výrazně ovlivňují konečné vlastnosti forminu a jeho umístění v buňce. Forminy se podílejí na řadě buněčných aktivit, často (ale ne vždy) souvisejících s cytoskeletem. Spravují například aktinovou složku cytoskeletu, propojují aktinová vlákna s mikrotubuly či plazmatickou membránou. Dále se účastní buněčného dělení a fungují jako složky tradičních signalizačních drah atd. Tato práce popisuje strukturu a funkci FH2 a FH1 domén, poskytuje přehled fylogenetických větví forminů u mnohobuněčných eukaryot a shrnuje rozličné role, kterých se forminy v buňkách (pravděpodobně) účastní. Není to malý cíl a (vzhledem k časovým a prostorovým omezením této práce) je nemožné ho splnit v míře, jakou si toto téma žádá.
|
|
|
Adaptor domains in signalling proteins: phosphorylation analysis and a role in mechanosensing
Tatárová, Zuzana ; Novotný, Marian (vedoucí práce) ; Doležal, Pavel (oponent)
P130Cas (Crk-associated substrate, CAS) je důležitým adaptorovým proteinem v integrínové signalizaci, který pozitivně ovlivňuje motilitu, invazivitu, proliferaci a přežívání buněk. CAS postrádá enzymatickou funkci, ale po vazbě jiných signálních proteinu může dojít ke změně fosforylace substrátové domény CAS, což je hlavní způsob, jakým se CAS účastní regulace signálních mechanismů v buňce. Ve fokálních adhezích dochází k lokálnímu pnutí, což vede k natažení substrátové domény, zpřístupnění fosforylačních míst pro kinázy a následně ke zvýšené fosforylaci substrátové domény. Na N-konci je CAS ve fokálních adhezích ukotven pravděpodobně interakcí SH3 domény CAS s kinázou FAK, avšak o ukotvení C-koncové části proteinu CAS není zatím nic známo. Cílem mého projektu je zjistit, jaké proteiny se podílejí na ukotvení proteinu CAS do fokálních adhezí. Objasnění způsobu ukotvení proteinu CAS do fokálních adhezí přispěje k pochopení mechanorecepční funkce proteinu CAS. Experimentální data poukazují na to, že tyrosinová fosforylace SH3 domény proteinu CAS ovlivňují její vazebné vlastnosti. Druhým cílem mého projektu bylo bioinformaticky analyzovat význam tyrosinové fosforylace SH3 domény a jiných adaptorových domén.
|
|
|
The biological importance of CAS SH3 domain tyrosine phosphorylation
Janoštiak, Radoslav ; Brábek, Jan (vedoucí práce) ; Dvořák, Michal (oponent)
Proteín CAS je hlavný tyrozín-fosforylovaný proteín v bunkách transformovaných virovými onkogénmi v-src a v-crk. Je to multidoménový adaptorový proteín slúžiaci ako lešenie pre zostavovanie signálnych komplexov dôležitých pre migráciu a invazivitu Src-transformovaných buniek. V N-koncovej SH3 doméne proteínu CAS bolo identifikované nové fosforylačné miesto - tyrozín 12 nachádzajúci sa na väzbovom povrchu SH3 domény. Pre štúdium biologického významu fosforylácie tyrozínu 12 boli pripravené nefosforylovateľná ( Y12F ) a fosfomimikujúca ( Y12E ) mutanta proteínu CAS. Zistili sme, že fosfomimikujúca mutácia Y12E znižuje asociáciu s kinázou FAK a fosfatázou PTP-PEST a taktiež znižuje tyrozínovú fosforyláciu kinázy FAK. Pomocou GFP značeného proteínu CAS sme následne zistili, že Y12E mutácia delokalizuje proteín CAS z fokálnych adhézií, pričom však nemá žiadny vplyv na lokalizáciu CAS do podozómov. Nefosforylovateľná mutácia Y12F zapríčiňuje hyperfosforyláciu substrátovej domény CAS a znižuje dynamiku fokálnych adhézií a s tým spojenú migračnú kapacitu myších embryonálnych fibroblastov ( MEF ) nezávisle na integrínovej signlizácii. Analogicky k migrácii, CAS Y12F znižuje i invazivitu Src-transformovaných MEF. Z výsledkov tejto diplomovej práce vyplýva dôležitosť fosforylácie Tyr 12 v SH3 doméne CAS pre...
|
|
|
Hledaní nových interakčních partnerů SH3 domény adaptorového proteinu p130Cas
Gemperle, Jakub ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Forstová, Jitka (oponent)
Protein p130Cas patří mezi hlavní tyrosin-fosforylované proteiny v buňkách transformovaných onkogeny v-crk a v-src. Jeho exprese je nezbytná pro invazivitu a tvorbu metastází v buňkách transformovaných aktivovanou kinázou Src. Vysoké hladiny exprese proteinu p130Cas u pacientů s rakovinou prsu jsou spojeny s větším rizikem návratu choroby, slabou odpovědí na léčbu tamoxifenem a horší prognózou. V netransformovaných buňkách je p130Cas fosforylován v substrátové doméně po stimulaci integrinů, což ovlivňuje buněčnou migraci a dynamiku cytoskeletu. Na této signalizaci se nepostradatelně podílí právě SH3 doména p130Cas. V této diplomové práci jsme jako první analyzovali pomocí metody Phage display a následně charakterizovali vazebný motiv SH3 domény p130Cas. Na základě tohoto vysokoafinitního motivu [AP]P[APMS]-K-P-[LPST]-[LR]-[LPST] jsme predikovali nové interakční partnery proteinu p130Cas a následně potvrdili interakci se Ser/Thr kinázou PKN3. Tato kináza kolokalizuje s p130Cas v jádře a perinukleární oblasti a mohla by p130Cas fosforylovat. V rámci této diplomové práce jsme také analyzovali vliv fosfomimikující mutace tyrosinu ze sekvence ALYD, která je konzervovaná v sekvenci SH3 domén, na schopnost těchto domén vázat ligandy. Tato mutace snižovala vazbu asi o 3 řády jak k ligandům I. třídy (SH3...
|
|
|
Strukturní a regulační aspekty aktivace kinázy Src
Koudelková, Lenka ; Brábek, Jan (vedoucí práce) ; Brdička, Tomáš (oponent) ; Hejnar, Jiří (oponent)
Kináza Src má stěžejní roli v množství fundamentálních buněčných procesů. Mimo jiné je součástí signálních drah řídících proliferaci, motilitu či diferenciaci a často bývá deregulována v různých typech nádorů. Aktivita Src proto podléhá přísné a komplexní regulaci, která je zprostředkována SH3 a SH2 doménami a fosforylačním stavem tyrosinů 416 a 527. V kompaktním inaktivním stavu kinázu udržují intramolekulárními inhibiční interakce. Jejich narušením dochází k otevření struktury Src a přechodu do aktivního stavu. Identifikovali jsme nový mechanismus, skrze který může být Src regulována. Jedná se o fosforylaci konzervovaného tyrosinu 90 vazebného povrchu SH3 domény, která vede ke snížení afinity SH3 domény k ligandům včetně CD linkeru a aktivaci kinázy. Fosfomimikujíci mutace tyrosinu 90 indukovala transformaci buněk a zvýšený invazivní potenciál. Jelikož je katalytická aktivita Src reflektována jeho strukturou, lze prostřednictvím stanovení tvaru kinázy usuzovat na její aktivitu. Na základě této korelace jsme sestrojili FRET senzor konformace Src umožňující sledovat s prostorovým a časovým rozlišením dynamiku aktivace kinázy v buňkách. Dokumentovali jsme, že aktivační mutace v SH3, SH2 i kinázové doméně nebo některé typy inhibitorů jsou schopny vyvolat otevření struktury Src. Analýza aktivace Src...
|
|
|
Strukturní a regulační aspekty aktivace kinázy Src
Koudelková, Lenka
Kináza Src má stěžejní roli v množství fundamentálních buněčných procesů. Mimo jiné je součástí signálních drah řídících proliferaci, motilitu či diferenciaci a často bývá deregulována v různých typech nádorů. Aktivita Src proto podléhá přísné a komplexní regulaci, která je zprostředkována SH3 a SH2 doménami a fosforylačním stavem tyrosinů 416 a 527. V kompaktním inaktivním stavu kinázu udržují intramolekulárními inhibiční interakce. Jejich narušením dochází k otevření struktury Src a přechodu do aktivního stavu. Identifikovali jsme nový mechanismus, skrze který může být Src regulována. Jedná se o fosforylaci konzervovaného tyrosinu 90 vazebného povrchu SH3 domény, která vede ke snížení afinity SH3 domény k ligandům včetně CD linkeru a aktivaci kinázy. Fosfomimikujíci mutace tyrosinu 90 indukovala transformaci buněk a zvýšený invazivní potenciál. Jelikož je katalytická aktivita Src reflektována jeho strukturou, lze prostřednictvím stanovení tvaru kinázy usuzovat na její aktivitu. Na základě této korelace jsme sestrojili FRET senzor konformace Src umožňující sledovat s prostorovým a časovým rozlišením dynamiku aktivace kinázy v buňkách. Dokumentovali jsme, že aktivační mutace v SH3, SH2 i kinázové doméně nebo některé typy inhibitorů jsou schopny vyvolat otevření struktury Src. Analýza aktivace Src...
|
|
|
Strukturní a regulační aspekty aktivace kinázy Src
Koudelková, Lenka
Kináza Src má stěžejní roli v množství fundamentálních buněčných procesů. Mimo jiné je součástí signálních drah řídících proliferaci, motilitu či diferenciaci a často bývá deregulována v různých typech nádorů. Aktivita Src proto podléhá přísné a komplexní regulaci, která je zprostředkována SH3 a SH2 doménami a fosforylačním stavem tyrosinů 416 a 527. V kompaktním inaktivním stavu kinázu udržují intramolekulárními inhibiční interakce. Jejich narušením dochází k otevření struktury Src a přechodu do aktivního stavu. Identifikovali jsme nový mechanismus, skrze který může být Src regulována. Jedná se o fosforylaci konzervovaného tyrosinu 90 vazebného povrchu SH3 domény, která vede ke snížení afinity SH3 domény k ligandům včetně CD linkeru a aktivaci kinázy. Fosfomimikujíci mutace tyrosinu 90 indukovala transformaci buněk a zvýšený invazivní potenciál. Jelikož je katalytická aktivita Src reflektována jeho strukturou, lze prostřednictvím stanovení tvaru kinázy usuzovat na její aktivitu. Na základě této korelace jsme sestrojili FRET senzor konformace Src umožňující sledovat s prostorovým a časovým rozlišením dynamiku aktivace kinázy v buňkách. Dokumentovali jsme, že aktivační mutace v SH3, SH2 i kinázové doméně nebo některé typy inhibitorů jsou schopny vyvolat otevření struktury Src. Analýza aktivace Src...
|
|
|
Strukturní a regulační aspekty aktivace kinázy Src
Koudelková, Lenka ; Brábek, Jan (vedoucí práce) ; Brdička, Tomáš (oponent) ; Hejnar, Jiří (oponent)
Kináza Src má stěžejní roli v množství fundamentálních buněčných procesů. Mimo jiné je součástí signálních drah řídících proliferaci, motilitu či diferenciaci a často bývá deregulována v různých typech nádorů. Aktivita Src proto podléhá přísné a komplexní regulaci, která je zprostředkována SH3 a SH2 doménami a fosforylačním stavem tyrosinů 416 a 527. V kompaktním inaktivním stavu kinázu udržují intramolekulárními inhibiční interakce. Jejich narušením dochází k otevření struktury Src a přechodu do aktivního stavu. Identifikovali jsme nový mechanismus, skrze který může být Src regulována. Jedná se o fosforylaci konzervovaného tyrosinu 90 vazebného povrchu SH3 domény, která vede ke snížení afinity SH3 domény k ligandům včetně CD linkeru a aktivaci kinázy. Fosfomimikujíci mutace tyrosinu 90 indukovala transformaci buněk a zvýšený invazivní potenciál. Jelikož je katalytická aktivita Src reflektována jeho strukturou, lze prostřednictvím stanovení tvaru kinázy usuzovat na její aktivitu. Na základě této korelace jsme sestrojili FRET senzor konformace Src umožňující sledovat s prostorovým a časovým rozlišením dynamiku aktivace kinázy v buňkách. Dokumentovali jsme, že aktivační mutace v SH3, SH2 i kinázové doméně nebo některé typy inhibitorů jsou schopny vyvolat otevření struktury Src. Analýza aktivace Src...
|
|
|
Vliv inhibice SH3 domény proteinu Crk na invazivitu nádorových buněk
Tomášová, Lea ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Protoonkogen Crk je spojován s nádory s agresivním a invazivním potenciálem. Protein Crk patří do skupiny adaptorových proteinů obsahujících SH2 a SH3 domény a hraje důležitou roli v buněčné signalizaci. Přes svoji SH2 doménu integruje signál přicházející od aktivovaných receptorů růstových faktorů a integrinů a předává jej na proteiny vázající jeho SH3 doménu. Ty potom aktivují malé GTPázy Rac1, Rap1 a Ras, které se podílí na regulaci buněčného pohybu, proliferace a přežívání. Cílem této diplomové práce bylo blokovat signalizaci proteinu Crk inhibicí jeho SH3 domény pomocí kompetitivního peptoidu, který váže SH3 doménu proteinu Crk s vysokou afinitou. Vazba tohoto inhibitoru na SH3 doménu brání navázání jejích buněčných vazebných partnerů a blokuje tak následný přenos signálu. V této diplomové práci byl analyzován vliv inhibice SH3 domény proteinu Crk na invazivní vlastnosti nádorových buněk. Pozorovaný inhibiční efekt na buněčnou invazivitu a schopnost buněk růst nezávisle na podkladu přináší důkaz o terapeutické relevanci cílení SH3 domény proteinu Crk pomocí peptoidového inhibitoru. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Biologický význam fosforylace tyrosinu 90 v SH3 doméně kinázy Src
Koudelková, Lenka ; Brábek, Jan (vedoucí práce) ; Brdička, Tomáš (oponent)
Kináza Src hraje zásadní roli v přenosu signálu z aktivovaných povrchových receptorů. Je součástí signálních drah podílejících se na kontrole buněčné proliferace, diferenciace nebo motility. Její aktivace proto podléhá přísné a komplexní regulaci. V inaktivní konformaci je Src držen intramolekulárními inhibičními vazbami. SH3 doména asociuje s polyprolinovým helixem CD linkeru, zatímco SH2 doména váže fosforylovaný C-koncový tyrosin 527. Obě regulační domény udržují kontakty s laloky kinázové domény, čímž stabilizují její katalyticky neaktivní formu. Přechod do aktivního stavu je spjat s rozrušením těchto inhibičních interakcí. Všechny konformační přestavby jsou významnou měrou ovlivněny fosforylačním statusem klíčových tyrosinů 416 a 527. Byl nalezen nový in vivo fosforylovatelný tyrosinový zbytek, jenž se projevil jako další regulátor aktivity kinázy. Jedná se o Tyr 90 SH3 domény Src, který pomáhá vytvářet jednu z hydrofobních vazebných kapes jejího interakčního povrchu. Na základě exprese fosfomimikující mutanty Src 90E v kvasinkách S. pombe a linii SYF je patrné, že fosforylace Tyr 90 vede ke zvýšení kinázové aktivity Src. Příčinou je vnesení záporného náboje fosfátu do hydrofobního vazebného povrchu SH3 domény, což způsobí snížení její afinity k CD linkeru. Src 90E má částečný transformační...
|
host ::
RSS.