|
|
Identifikace DNA rostlinných a živočišných druhů v potravinách použitím polymerázové řetězové reakce
Šmíd, Jiří ; Hanák,, Petr (oponent) ; Timko,, Jozef (oponent) ; Kuchta, Tomáš (vedoucí práce)
Na tři potravinové alergeny rostlinného původu – soju, pistácie a mandle – jsme vyvíjeli metody na jejich detekování v potravinách. Na detekci sóje (Glycine max) v potravinách jsme použili real-time PCR orientovanou na gen lec kódující lektin specifický pro sóju. Na tuto cílovou sekvenci byl orientovaný PCR systém s primery Le2F a Le2R a se sondou Le2P typu Taqman. Byla stanovena inkluzivita i exkluzivita systému, dále byl zjištěn detekční limit (2,75 pg) a praktický detekční limit (0,02 %). Celý navržený systém pak byl kvantifikován. Na detekci pisácií (Pistacia) byla použita real-time PCR založená na primerech a sondě orientované na gen COR kódující dehidrin. Byla stanovena inkluzivita i exkluzivita systému, dále byl zjištěn detekční limit (3,5 pg) a praktický detekční limit (0,002 %). Na detekci mandlí (Amygdalus) se nepodařilo vyvinout žadný systém, který by 100 % splňoval všechny kvalitativní parametry.
|
|
|
Foodborne Staphylococcus Aureus: Identification and Enterotoxin Production in Milk and Cheese.
Hrušková, Vendula ; Španová, Alena (oponent) ; Kmet,, Vladimír (oponent) ; Kaclíková, Eva (vedoucí práce)
Foodborne diseases caused by bacteria are an actual issue worldwide. To produce food, which is safe for human consumption, data about food-borne pathogen virulence is required to complement the already existing knowledge about the bacterial growth and survival in food. There is also a growing need for rapid and sensitive methods to detect these pathogens. In this dissertation, the real-time PCR-based method for the detection of S. aureus in food using selective enrichment and the impact of environmental factors on S. aureus growth and enterotoxin production in milk and cheese are described. We developed a rapid and sensitive method for the detection of S. aureus in food using selective enrichment and a new species-specific real-time PCR. The method facilitated the detection of S. aureus on the next day after the sample reception. This method can be used for S. aureus detection as a faster, highly specific, and more sensitive alternative to the microbiological method. We investigated the effect of three different temperatures, 8°C, 12°C and 20°C on S. aureus growth and SED production in pasteurized milk and on growth, sed gene expression and SED production in Brain heart infusion. The experiments were performed in small-scale fermentors for six days and gene expression was followed by qRT-PCR. SED production was measured using Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). In BHI the growth pattern was the same at 20°C and 12°C but delayed in the latter. At 8°C there was no growth. In milk, growth was lower compared to BHI. sed mRNA was detected at 20°C and 12°C after 4 and 7 hours respectively in BHI and the production occurred during the exponential phase of growth. In milk the SED production at 20°C and 12°C occurred earlier in growth but a lower total amount was produced compared to BHI. At 8°C, there was no SED production like in BHI. The combined effect of low temperature, 12°C, and the presence of competing background microflora derived from raw milk on the growth of S. aureus and SED production in pasteurized milk was further investigated. An inhibitory effect on S. aureus growth and enterotoxin production was observed and the impact of competition was greater than the impact of low temperature. The enterotoxin production was low and correlated with the growth. By lowering the amount of competing microflora and increasing the inoculation level of S. aureus, only a slight increase in enterotoxin production occurred. In the next stage, two different cheese matrices were inoculated with S. aureus to simulate a post-contamination scenario in cheese manufacture. Samples were collected over period of 4 weeks. Critical food factors, like competing microflora and pH, which are responsible for down- and up-regulation of the virulence of S. aureus, were monitored. We tried to indentify if there are situations in which: (i) no growth but enterotoxin formation is observed, and (ii) growth and no enterotoxin formation occurs.
|
|
|
Vliv PUFA n-3 na expresi genů kódujících proteiny řídící homeostázu cholesterolu
Hyblerová, Dagmar
Cílem této práce bylo potvrdit to, že polynenasycené mastné kyseliny n-3 (PUFA n-3) mají pozitivní vliv na hladinu plazmatických lipidů. Tyto kyseliny mohou snižovat cholesterol díky zvýšení exprese genu Insig-1 a zároveň snížení exprese genů kódujících Hmgcr a Ldlr. To jsme testovali na pokusných potkanech, kterým bylo do krmné směsi přidáno 6% oleje světlice barvířské, 6% rybího oleje či 6% oleje z řasy Schizochytrium. Relativní exprese genu Insig-1 byla u pokusné skupiny s přídavkem rybího oleje 120% kontroly (P<0,05) a u skupiny s přídavkem oleje z řasy Schizochytrium byla relativní exprese 170% kontroly (P<0,05). Tyto výsledky potvrzují pouze část naši hypotézy, neboť relativní exprese genu Hmgcr a Ldlr byla u pokusné skupiny s přídavkem rybího oleje 103% (P>0,05) a 101% kontroly (P>0,05) a u skupiny s přídavkem oleje z řasy Schizochytrium byla relativní exprese 117% (P>0,05) a 156% (P>0,05) oproti kontrole. Tedy ke snížení relativní exprese těchto genů nedošlo. Nicméně jsme prokázali, že PUFA n-3 přispívají ke snížení plazmatického cholesterolu a to v našem případě až o 20% kontroly. Koncentrace cholesterolu u skupiny s přídavkem oleje ze světlice barvířské byla 1,35 mmol.l-1, u skupiny s přídavkem rybího oleje 0,98 mmol.l-1.
|
|
| |
|
|
Využití molekulárně biologických metod při diagnostice cytomegaloviru (CMV)
ŠIMEROVÁ, Erika
Lidský cytomegalovirus (HCMV nebo CMV) je lidský virový patogen ze skupiny herpetických virů, které se nacházejí v rozvinutých i méně rozvinutých společnostech a u všech věkových skupin. V této práci bylo porovnáváno kvalitativní stanovení DNA CMV pomocí dvou metod PCR. Jednou z nich byla in house metoda. Zde se pomocí nested PCR se dvěma páry specifických primerů amplifikují úseky virové DNA CMV, které jsou následně detekovány na agarózovém gelu. Vizualizace takto získaných produktů PCR na agarózovém gelu se děje za pomocí interkalačního činidla ? ethidium bromidu. Tato metoda je velmi citlivá, ale časově náročná. Jako druhá metoda pro kvalitativní stanovení DNA CMV byla použita metoda real-time PCR na přístroji Rotor Gene. Detekce probíhá v reálném čase pomocí fluorescenčních barviv. Barviva jsou zpravidla vázána na oligonukleotidové sondy, které se specificky vážou na PCR amplifikát. Detekce PCR produktů je prováděna na základě intenzity fluorescence v průběhu PCR v reálném čase. Systém je zároveň schopen identifikovat potenciální PCR inhibici za přítomnosti interní kontroly. Tato metoda se jeví jako časově výhodnější, proto byla zavedena jako běžně užívaná metoda pro kvalitativní stanovení DNA CMV. Metody nested PCR a real-time PCR mají srovnatelnou citlivost a jsou srovnatelné i po finanční stránce. Pro jejich srovnání bylo použito 150 vzorků krve a krevní plazmy od 75 jedinců. Záchyt DNA CMV byl srovnatelný. Jen v jednom případě nebyl zachycen pozitivní výsledek u metody real-time na přístroji Rotor Gene, zatímco metoda nested PCR jej zachytila. I tak se metoda real-time PCR jeví jako velmi výhodná metoda pro kvalitativní stanovení DNA CMV a to i díky používání interních kontrol.U pacientů po transplantacích, u novorozenců, u onkohematologických pacientů je třeba kvůli léčbě provádět kvantitativní stanovení DNA CMV. V této práci byla pro kvantitativní stanovení používána metoda real-time PCR na přístroji Light Cycler. CMV LC Master obsahuje reagencie a enzymy pro specifickou amplifikaci 105bp dlouhého úseku genomu CMV a také pro bezprostřední detekci amplifikátu pomocí přístroje Light Cycler. I zde se nachází amplifikační systém pro průkaz potenciální PCR inhibice založený na detekci interní kontroly. Analytický limit detekce přitom není negativně ovlivněn. Množství CMV viru ve vzorku se určuje pomocí kvantifikovaných standard, které jsou součástí kitu. Analyzátor vypočítává titr virové DNA v testovaných vzorcích porovnáním signálu u každého vzorku se signálem kvantitativního standardu, jenž je přiřazen ke kalibrační křivce daného balení kitu. Kvantitativní stanovení se pak uvádí v množství kopií/1 ml vzorku. Právě na základě monitorinku kvantitativního stanovení se u pacientů určuje délka léčby CMV infekce. Izolace DNA lze provádět ručně nebo pomocí automatických přístrojů ? izolátorů.Ve své práci jsem se zaměřila na srovnání těchto dvou odlišných izolací. Ruční izolaci jsem prováděla pomocí izolačního QIAmp DNA Mini Kitu od firmy QIAGEN. Automatizovanou izolaci jsem prováděla na izolátoru MagCore za použití MagCore Genomic DNA whole Blood Kitu (RBCBioscience). Pro srovnání obou izolací byly současně použity jako klinické materiály krev a krevní plazma vždy od stejného jedince. Obě metody izolací pak byly následně použity pro kvalitativní i kvantitativní stanovení CMV DNA. Z výsledků kvantitativních stanovení vyplývá, že obě použité izolace jsou srovnatelné, tzn. lze použít obě izolace se stejným kvantitativním výsledkem.
|
|
|
Leidenská mutace - význam a způsob vyšetření
FIALOVÁ, Kateřina
Tématem práce je Leidenova mutace význam a způsob vyšetření. Práce se zabývá frekvencí výskytu FV Leidenské mutace ve vzorcích vyšetřovaných v centru laboratorní medicíny BioLab, spol. s. r. o., Klatovy. Trombofilie (nebo-li hyperkoagulační stav) je vrozená nebo získaná porucha hemostatického mechanizmu, která je spjata se zvýšeným rizikem vzniku trombóz. Nejvýznamnějším a také nejčastějším projevem trombofilie je venózní nebo-li žilní tromboembolizmus. Tento pojem zahrnuje jak hlubokou žilní trombózu, tak plicní embolii a na jejím vzniku se vždy podílí několik faktorů, získaných či vrozených. Mutace faktoru V byla popsána roku 1993 jako rezistence na aktivovaný protein C (APC- rezistence). Je nejčastější vrozenou trombofilií bílé rasy a vyskytuje se až u 40% pacientů, u kterých byla diagnostikována tromboembolie. Leidenská mutace v genu pro faktor V je nejčastější genetickou predispozicí k trombózám. Riziko vzniku žilního tromboembolismu se liší podle toho jednáli-li se o heterozygotního či homozygotního nosiče. Heterozygotní jedinci mají 7× vyšší riziko vzniku žilní trombózy a homozygoti mají toto riziko vyšší až 80×. Prevalence FV Leidenské mutace se ve světě pohybuje od 0 do 15 %. APC- rezistence je způsobena bodovou mutací v polynukleotidovém řetězci genu pro faktor V. Zde dojde k záměně v pořadí nukleotidů, a to dusíkaté báze guaninu za adenin na pozici 1691 (G1691A). Takto vzniklý triplet kóduje v pozici 506 na místo aminokyseliny argininu ? Arg, R, glutamin ? Gln, Q (R506Q) . To způsobí odolnost aktivního faktoru V vůči proteinu C, který ho má inaktivovat. Faktor V tedy zůstává dál prokoagulační a tak roste tvorba trombinu a společně s ním riziko tromboembolické nemoci. Cílem práce bylo shrnutí současných poznatků na téma FV Leidenské mutace- význam a způsob vyšetření, analyzovat vzorky plné krve pacientů vyšetřovaných na přenašečství Leidenské mutace v centru laboratorní medicíny BioLab, spol. s. r. o. Klatovy a následně vyhodnotit a interpretovat zjištěné výsledky. Přenašečství FV Leidenské mutace bylo sledováno u souboru pacientů obou pohlaví pocházejících z Plzeňského a Ústeckého kraje za pomoci metody Real-time PCR. Z celkového počtu 169 vyšetřených pacientů bylo získáno 111 vzorků od žen a 58 vzorků od mužů. Mezi ženami bylo nalezeno 21 heterozygotních nosiček (18,9 %) a 1 homozygotní nosička (0,9 %) FV Leidenské mutace. V rámci mužské populace byl zjištěn výskyt 17 heterozygotů (29,3 %). Žádný z mužů nebyl nositelem homozygotního genotypu FV Leidenské mutace. Přestože byli muži dvakrát častějšími nosiči zmíněné mutace, nebyl statistickými analýzami prokázán vliv pohlaví na přenos FV Leidenské mutace (P=0,2).
|
|
|
Porovnání metod stanovení Neisseria meningitidis v Nemocnici ČB a.s.
SKOŘEPOVÁ, Lucie
Molekulárně biologické metody mají velký význam pro běžnou diagnostiku infekčních onemocnění. V této práci byly porovnávány dvě molekulárně biologické metody pro diagnostiku Neisseria meningitidis v Nemocnici ČB a.s.. Při stanovení hypotézy jsem vycházela z předpokladu, že real-time PCR je rychlejší než nested PCR. Obě tyto metody se používají v Nemocnici ČB a.s. pro diagnostiku Neisseria meningitidis. Během experimentu jsem zjistlila, že se v Nemocnici ČB a.s. používá jiná rychlejší metoda - latexová aglutinace, která vykazuje oproti molekulárně biologickým metodám vyšší procento falešně negativních výsledků. Tyto falešně negativní výsledky mohou být způsobeny napřiklad degradací Neisseria meningitidis ve vzorku. Usmrcení Neisseria meningitidis neovlivňuje výsledky molekulárně biologických metod, neboť stanovují bakteriální DNA narozdíl od latexové aglutinace, která prokazuje imunologickou reakci živé bakterie. U jednotlivých metod PCR jsem porovnávala čas potřebný pro průkaz Neisseria meningitidis. Experimentem jsem potvrdila, že real-time PCR je rychlejší než nested PCR. Dále jsem zjistila, že real-time PCR je o jeden řád citlivější než nested PCR.
|
|
|
Metodika detekce vnitřního genu hrachu setého lektinu pomocí PCR: metodika pro praxi
Vráblík, Aleš ; Hodek, Jan ; Ovesná, Jaroslava
Metodika popisuje detekci vnitřního genu hrachu setého lektinu pomocí PCR a real-time PCR s využitím nově vyvinutých specifických primerů. Podstatou zkoušky je zjistit ve vzorku přítomnost nukleotidové sekvence specifické pro lektin, vnitřní gen hrachu setého. Vzhledem k tomu, že v řadě matric je DNA poškozena výrobními postupy, využívá se amplifikace krátkého úseku DNA. Po amplifikaci cílové DNA metodou PCR následuje elektroforetická separace PCR produktů v agarózovém gelu. V transiluminátoru se poté v UV světle vizualizuje hledaný PCR produkt v podobě proužku svítícího na gelu v předem určené pozici. Nově vyvinuté primery byly rovněž verifikovány pro metodu real-time PCR s využitím SYBR® Green detekce. U dané metody byla ověřena specificita a rovněž byl stanoven detekční a kvantifikační limit.
Plný text:  PDF
|
|
|
Vývoj a optimalizace metodiky pro detekci GMO brambor
ČERMÁKOVÁ, Jitka
Geneticky modifikované (GM) nebo transgenní plodiny, dnes často označované jako {\clqq}Biotech plodiny`` jsou komerčně pěstovány od roku 1996. Zároveň od tohoto roku jsou komerčně pěstovány i GM brambory v USA, Mexiku, Kanadě a později v Jižní Africe, Číně a Indii. V roce 2006 byla celková plocha schválených Biotech plodin 102 milionů hektarů a Biotech plodiny byly pěstovány ve dvaadvaceti státech, jedenáct z nich bylo průmyslových a jedenáct rozvojových. Česká republika je jednou ze šesti států Evropské unie, kde jsou v současné době pěstovány Biotech plodiny. Jedním z nejpřesvědčivějších důvodů pro pěstování Biotech plodin je jejich schopnost zvyšovat produktivitu a stabilitu produkce, uchovávat biodiversitu a jejich schopnost produkce obnovitelných zdrojů založených na bio-palivech, čímž se z Biotech plodin stává technologie, která chrání prostředí. Tato diplomová práce byla zaměřena na vyvinutí rychlé, přesné a levné metody, založené na PCR, pro detekci transgenu v bramborách {--} hlízách a listech, umožňující sledovat přítomnost GMO v obchodovaných bramborách a výrobcích i případnou kontaminaci prostředí.
|
|
| |
host ::
RSS.