|
|
Analýza mikrobiálního složení vybraných probiotických výrobků metodou PCR-HRM
Tomanová, Barbora ; Španová, Alena (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Práce byla zaměřena na průkaz probiotických bakterií ve čtyřech různých probiotických výrobcích (probiotický krém, probiotické tampóny, orální probiotikum a sójový nápoj s probiotiky). Byla ověřena viabilita bakterií obsažených ve výrobcích. Z komplexních matric výrobků byla izolována DNA v kvalitě vhodné pro metodu PCR s následnou identifikací deklarovaných bakteriálních rodů a druhů. K amplifikaci pomocí konvenční PCR a PCR v reálném čase byly použity rodově a druhově specifické primery. Ve výrobcích byly prokázány bakterie rodu Lactobacillus a Bacillus a bakteriální druhy Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum a Lactobacillus gasseri. Následně byla testována možnost rozlišení směsi bakteriálních druhů v DNA izolované z probiotického tampónu metodou PCR-HRM. K tomu bylo testováno pět sad primerů. Jako nejvhodnější pro rozlišení byly vyhodnoceny 2 sady primerů (primery P1V1, P2V1 a V1F-HRM, V1R-HRM).
|
|
|
Magnetické částice a jejich využití v biotechnologii
Knápková, Monika ; Konečná, Jana (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Práce je zaměřena na magnetické částice, které jsou využívány v řadě biotechnologických aplikací. Teoretická část práce pojednává o specifických vlastnostech těchto částic, o materiálech, kterými mohou být tvořeny a dále jsou zmíněny některé biotechnologické aplikace využívající magnetické částice. V experimentální části byly využity vybrané druhy magnetických částic za účelem izolace nukleových kyselin. Kvalita izolované DNA s ohledem na čistotu byla vyhodnocena za použití metody polymerázové řetězové reakce a jejích modifikací. Dále byla využita vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM analýza) za účelem ověření kvality izolované DNA a pro rozlišení bakterií Lactobacillus casei a Lactobacillus rhamnosus. Izolace DNA pomocí magnetických nosičů byla úspěšná, přičemž z hlediska koncentrace byly nejvhodnější komerčně dostupné mikronosiče MPG a magnetické mikročástice typu Fkol 77ox. Z hlediska čistoty byly pro izolaci DNA nejlepší magnetické nanočástice F79/L3 PLL. Bakteriální druhy Lactobacillus casei a Lactobacillus rhamnosus se pomocí HRM analýzy nepodařilo rozlišit.
|
|
|
Identifikace DNA rostlinných a živočišných druhů v potravinách použitím polymerázové řetězové reakce
Šmíd, Jiří ; Hanák,, Petr (oponent) ; Timko,, Jozef (oponent) ; Kuchta, Tomáš (vedoucí práce)
Na tři potravinové alergeny rostlinného původu – soju, pistácie a mandle – jsme vyvíjeli metody na jejich detekování v potravinách. Na detekci sóje (Glycine max) v potravinách jsme použili real-time PCR orientovanou na gen lec kódující lektin specifický pro sóju. Na tuto cílovou sekvenci byl orientovaný PCR systém s primery Le2F a Le2R a se sondou Le2P typu Taqman. Byla stanovena inkluzivita i exkluzivita systému, dále byl zjištěn detekční limit (2,75 pg) a praktický detekční limit (0,02 %). Celý navržený systém pak byl kvantifikován. Na detekci pisácií (Pistacia) byla použita real-time PCR založená na primerech a sondě orientované na gen COR kódující dehidrin. Byla stanovena inkluzivita i exkluzivita systému, dále byl zjištěn detekční limit (3,5 pg) a praktický detekční limit (0,002 %). Na detekci mandlí (Amygdalus) se nepodařilo vyvinout žadný systém, který by 100 % splňoval všechny kvalitativní parametry.
|
|
|
Použití PCR v reálném čase pro charakterizaci nosičů používaných pro izolaci DNA
Ondrejková, Martina ; Šálek, Petr (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Teoretická časť diplomovej práce bola zameraná na magnetické nosiče zložené z magnetického jadra pokrytého polymérnou vrstvou, využívané prevažne v medicínskych, molekulárno-biologických a biochemických aplikáciach. Enkapsulácia jadra je pre uvedené aplikácie podstatná z dôvodu zníženia nešpecifickej adsorbcie proteínov, zvýšenia biokompatiblity a možnej funkcionalizácie magnetických nosičov. V experimentálnej časti práce bola amplifikovaná DNA (E.coli) pomocou polymerázovej reťazovej reakcie v reálnom čase (PCR v reálnom čase) v prítomnosti magnetických nosičov pokrytých kopolymérom polyhydroxymetakrylátom-glycidylmetakrylátom (P(HEMA-co-GMA)) s obsahom alebo bez obsahu karboxylových funkčných skupín. Inhibičný efekt magnetických nosičov rôznej koncentrácie v PCR zmesi bol vyhodnocovaný z hodnôt parametrov kalibračných priamok získaných regresnou analýzou. Prítomnosť špecifického produktu PCR bola overovaná agarózovou gélovou elektroforézou. Väčšina magnetických nosičov bez obsahu karboxylových skupín zhášala fluorescenciu v rozsahu koncentrácií 2,0 – 4,0 g.l-1 v PCR zmesi, inhibícia amplifikácie DNA sa nepreukázala a sú teda biokompatibilné. Magnetické nosiče s obsahom karboxylových skupín zhášali fluorescenciu už pri nižších koncentráciách, v rozsahu 0,4 – 4,0 g.l-1 v PCR zmesi. Bola preukázaná ich inhibícia amplifikácie v rozsahu koncentrácií 2,0 – 4,0 g.l-1 v PCR zmesi, od koncentrácie0,8 g.l-1 v PCR zmesi inhibícia nenastala a nosiče sú biokompatibilné. Výsledky nezáviseli od charakteristických vlastností magnetických nosičov ale od prítomnosti karboxylových skupín na povrchu nosiča a stupňa pokrytia magnetického jadra polymérom. PCR v reálnom čase sa preukázala ako účinný nástroj pre štúdium enkapsulácie magnetického jadra a vplyvu funkčných skupín na povrchu polymérnej vrstvy.
|
|
|
Foodborne Staphylococcus Aureus: Identification and Enterotoxin Production in Milk and Cheese.
Hrušková, Vendula ; Španová, Alena (oponent) ; Kmet,, Vladimír (oponent) ; Kaclíková, Eva (vedoucí práce)
Foodborne diseases caused by bacteria are an actual issue worldwide. To produce food, which is safe for human consumption, data about food-borne pathogen virulence is required to complement the already existing knowledge about the bacterial growth and survival in food. There is also a growing need for rapid and sensitive methods to detect these pathogens. In this dissertation, the real-time PCR-based method for the detection of S. aureus in food using selective enrichment and the impact of environmental factors on S. aureus growth and enterotoxin production in milk and cheese are described. We developed a rapid and sensitive method for the detection of S. aureus in food using selective enrichment and a new species-specific real-time PCR. The method facilitated the detection of S. aureus on the next day after the sample reception. This method can be used for S. aureus detection as a faster, highly specific, and more sensitive alternative to the microbiological method. We investigated the effect of three different temperatures, 8°C, 12°C and 20°C on S. aureus growth and SED production in pasteurized milk and on growth, sed gene expression and SED production in Brain heart infusion. The experiments were performed in small-scale fermentors for six days and gene expression was followed by qRT-PCR. SED production was measured using Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). In BHI the growth pattern was the same at 20°C and 12°C but delayed in the latter. At 8°C there was no growth. In milk, growth was lower compared to BHI. sed mRNA was detected at 20°C and 12°C after 4 and 7 hours respectively in BHI and the production occurred during the exponential phase of growth. In milk the SED production at 20°C and 12°C occurred earlier in growth but a lower total amount was produced compared to BHI. At 8°C, there was no SED production like in BHI. The combined effect of low temperature, 12°C, and the presence of competing background microflora derived from raw milk on the growth of S. aureus and SED production in pasteurized milk was further investigated. An inhibitory effect on S. aureus growth and enterotoxin production was observed and the impact of competition was greater than the impact of low temperature. The enterotoxin production was low and correlated with the growth. By lowering the amount of competing microflora and increasing the inoculation level of S. aureus, only a slight increase in enterotoxin production occurred. In the next stage, two different cheese matrices were inoculated with S. aureus to simulate a post-contamination scenario in cheese manufacture. Samples were collected over period of 4 weeks. Critical food factors, like competing microflora and pH, which are responsible for down- and up-regulation of the virulence of S. aureus, were monitored. We tried to indentify if there are situations in which: (i) no growth but enterotoxin formation is observed, and (ii) growth and no enterotoxin formation occurs.
|
|
|
Důkaz vybraných druhů červeného ovoce v potravinách rostlinného původu pomocí multiplex PCR a instrumentálních metod
Vybíralová, Natálie ; Langová, Denisa (oponent) ; Fialová, Lenka (vedoucí práce)
Stále častěji se potraviny stávají předmětem falšování, výjimkou nejsou ovocné výrobky, které obsahují jahody, borůvky a maliny. Tato bakalářská práce je zaměřena na detekci jahod, borůvek a malin v modelových i reálných ovocných produktech pomocí multiplex PCR a HPLC. Teoretická část pojednává o složení červeného ovoce, jeho významu ve výživě člověka a především o izolaci DNA z rostlinného materiálu. Cílem experimentální části práce byla analýza vybraných komerčních ovocných pyré obsahujících maliny, jahody a borůvky a jejich replik pomocí vybraných instrumentálních a molekulárně-biologických metod a následné srovnání výsledků těchto metod. Komerční ovocná pyré byla zakoupena v maloobchodní síti a modelové směsi (repliky těchto pyré) byly připraveny v laboratoři. Z ovocných pyré byla vyizolována DNA, která byla po potvrzení její amplifikovatelnosti úspěšně využita v multiplex PCR pro důkaz malin, jahod a borůvek.V instrumentální části byly pomocí HPLC u modelových a komerčních směsí detekovány určité látky specifické pro červené ovoce.
|
|
|
Využití metody PCR-HRM analýzy pro identifikaci bakterií v potravinách a doplňcích stravy
Šurková, Alice ; Illková, Kateřina (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Teoretická část práce se věnuje potravinám a potravinovým doplňkům s obsahem mikroorganismů, především bakterií. Dále pojednává o metodách identifikace těchto bakterií, především o polymerázové řetězové reakci (PCR). Zahrnuje také PCR v reálném čase a zvláštní pozornost je věnována vysokorozlišovací analýze křivky tání (HRM). V experimentální části byla z vybraného probiotického výrobku izolována DNA pomocí magnetických mikročástic. Byla stanovena její koncentrace a dále byla podrobena PCR s následnou detekcí agarózovou gelovou elektroforézou. Pro upřesnění výsledků byla provedena také HRM analýza.
|
|
|
Identifikace rostlinné DNA v komplexní matrici pomocí molekulárních technik
Papala, František ; Langová, Denisa (oponent) ; Němcová, Andrea (vedoucí práce)
Cílem bakalářské práce je identifikace rostlinné DNA v komplexní matrici pomocí molekulárních technik. Práce nejprve vychází z rešerše literárních zdrojů zaměřených na molekulární techniky identifikace DNA a pak se teoreticky zabývá metodami izolace a charakterizace rostlinné DNA. Konkrétně se bude pracovat s DNA borůvky. V experimentální části byla měřena čtveřice komerčních produktů, ze kterých byla izolována DNA a následně byla podrobena PCR a HRM analýze.
|
|
|
Negativní vliv tzv. "raw" potravin z hlediska možné mikrobiální kontaminace
Šťastná, Martina ; Hlaváček, Viliam (oponent) ; Němcová, Andrea (vedoucí práce)
Raw strava je aktuálnym trendom v oblasti výživy, najmä kvôli konzumácii vyváženej stravy s vysokým podielom zdraviu prospešných látok. Základom je konzumácia čerstvých potravín, ktoré neprešli tepelnou úpravou presahujúcou 42 – 45 °C. Témou bakalárskej práce je všeobecná charakterizácia raw stravy, jej bezpečnosť z hľadiska možnej mikrobiálnej kontaminácie a stanovenie významných živín a aktívnych látok obsiahnutých v raw produktoch. V teoretickej časti sú popísané najrozšírenejšie typy stravovania, priblíženie raw stravy z hľadiska jej výhod a nevýhod. Ďalej sú popísané najvýznamnejšie baktérie, kvasinky a plesne vyskytujúce sa na ovocí a zelenine. Vybranými metódami popísanými v teoretickej časti boli stanovené niektoré živiny a aktívne zložky vo vzorkách raw tyčiniek. Experimentálna časť popisuje postupy a princípy stanovenia spomínaných látok a v neposlednom rade postupy metódy PCR v reálnom čase, elektroforézu na agarózovom géle a metódu očkovania vzoriek na selektívne pevné médiá, ktoré priblížili možnosť výskytu nežiaducich mikroorganizmov v raw tyčinkách a zákusku. Napriek veľkému množstvu výhod konzumácie raw potravín a produktov z nich vyrobených, je potrebné dbať na svoje zdravie aj z hľadiska možnej kontaminácie mikroorganizmami. Rizikom sa stáva fakt, že potrava pri príprave nie je zbavená nežiaducich mikroorganizmov. To je dôvodom pre to, aby boli raw produkty po otvorení skonzumované v čo najkratšej dobe, pretože sa vzhľadom na svoje zloženie ľahko stávajú nutričným zdrojom pre rôzne typy mikroorganizmov.
|
|
|
Optimalizace izolace DNA jogurtových kultur a její detekce pomocí RT-PCR
Šurková, Alice ; Němcová, Andrea (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V rámci práce byla optimalizována izolace DNA z čistých jogurtových kultur i z jogurtových výrobků. Izolovaná DNA byla následně podrobena analýze pomocí RT-PCR. V první části práce byla vyhodnocena izolace DNA z čistých jogurtových kultur pomocí komerčního kitu jako efektivnější než izolace fenolovou extrakcí a pomocí magnetických mikročástic. K posouzení kvality a kvantity získané DNA bylo použito spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty a qPCR. Pomocí komerčního kitu pak byla získána DNA v kvalitě vhodné pro PCR celkem z deseti čistých jogurtových kultur. V druhé části práce byla provedena izolace bakteriální DNA z jogurtových výrobků pomocí komerčního kitu s předchozím promytím vzorků lyzačním roztokem. Takto byla DNA izolována ze šesti jogurtových výrobků. Dále byly z těchto výrobků zaočkováním do mléka vyrobeny dvě várky domácích jogurtů, z nichž byla izolována DNA stejným způsobem. DNA získaná z jogurtů byla podrobena RT-PCR se šesti dvojicemi primerů (V3_F a V3_R, V6_F a V6_R, V1_F a V1_R, GroHRM_F a GroHRM_R, UPF a UPR, P1V1 a P2V1) a s DNA z čistých kultur jako pozitivními kontrolami. Z výsledků byla potvrzena přítomnost deklarovaných kultur v jednotlivých jogurtech a jejich schopnost množit se i po zaočkování do nového média (mléka).
|
host ::
RSS.