|
|
Porovnání metod izolací dvouvláknové RNA z rostlinného pletiva se zaměřením na výtěžnost virové frakce
MATYÁŠOVÁ, Alena
Pro diagnostiku rostlinných patogenů lze využít masivně paralelní sekvenování (HTS), které má výhodu v sekvenčně nespecifickém zachycení sekvencí všech přítomných organismů ve vzorku. Vstupní materiál lze připravit více metodami podle účelu použití. Cílem této práce je porovnat kvalitativní a kvantitativní profil dvou metod pro izolaci RNA z rostlinného pletiva s obohacením o dvouvláknové frakce za účelem zvýšení množství virových RNA vůči RNA hostitelské rostliny. Srovnávanými metodami jsou běžně využívaná afinní celulózní chromatografie a diferenciální centrifugace s LiCl. Jako výzkumný soubor byla použita rostlina jetele lučního (Trifolium pratense L.) infikovaná viry s jednovláknovými a dvouvláknovými RNA genomy. Tyto viry byly v rostlině v minulosti detekovány pomocí HTS. Testovanými metodami byly z rostliny extrahovány ribonukleové kyseliny. Pomocí metody RT-PCR byly amplifikovány specifické fragmenty osmi virů a po vyhodnocení gelové elektroforézy byl porovnán kvalitativní profil obou metod. Pro porovnání kvantitativního profilu byly vybrány tři viry s různými druhy RNA genomů. Metodou RT-qPCR byla provedena jejich relativní kvantifikace. S využitím softwaru Bio-rad CFX Manager 3.1 byla vyhodnocena normalizovaná exprese jednotlivých virů k 26S ribozomální RNA jako referenční kontrole. Pomocí obou porovnávaných metod byla detekována přítomnost všech testovaných virů. Po vyhodnocení kvantifikačních dat a provedení statistických testů (F-test, T-test) s hladinou významnosti = 0,05 bylo shledáno, že mezi metodou afinní celulózní chromatografie a metodou s diferenciální centrifugací s LiCl není signifikantní rozdíl.
|
|
|
The role of miR-150 in the physiopathology of oligoarticular juvenile idiopathic arthritis
Diviš, Daniel ; Pávek, Petr (vedoucí práce) ; Soukup, Tomáš (oponent)
Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Student: Daniel Diviš Školitel: Prof. Dr. Florence Apparailly, Directrice de Recherche Prof. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D. (formální školitel) Název diplomové práce: Role miR-150 v patofyziologii oligoartikulární juvenilní idiopatické artritidy Juvenilní idiopatická artritida (JIA) je nejčastější chronické onemocnění revmatoidního charakteru postihující děti, přesto jsou mechanismy jeho patofyziologie z velké části neprozkoumány. Zásadní roli hrají v těchto procesech složky vrozené a získané imunity, včetně buněk myeloidní řády. U zánětlivých onemocnění byly popsány epigenetické deregulace zahrnující i nekódující mikroRNA. Mimoto, předběžné výsledky získané týmem Prof. Florence Apparailly ukázaly akumulaci přechodných monocytů a zároveň vyšší expresi miR-150 v synoviální tekutině dětí postižených oligoartikulární JIA. Na základě těchto objevů vznikla hypotéza naznačující určitou roli miR-150 v patofyziologii tohoto onemocnění, přesněji v regulaci diferenciace monocytů a jejich funkcí. Za účelem prostudování účinku, který má miR-150 na monocyty, bylo provedeno několik transfekcí klasických monocytů (separovaných z periferní krve zdravých dárců) inhibitorem miR-150. Buňky byly následně označeny příslušnými...
|
|
|
Vyšetření genetických predispozic pro celiakii v rodině s výskytem onemocnění diabetes mellitus 1. Typu
KUČEROVÁ, Klára
Celiakie patří mezi autoimunitní onemocnění, které postihuje především sliznici tenkého střeva. Onemocnění je charakterizováno nesnášenlivostí gliadinu, který je součástí lepku. Intolerance vede k chronickému zánětu na sliznici tenkého střeva a tím dochází k chronickému průjmu, tukovité stolici, zvracení, únavě a v neposlední řadě také neprospívání. Diabetes melitus I. typu je autoimunitní metabolické onemocnění, které se projevuje hyperglykémií (zvýšená hladina glukózy v krvi), která je důsledkem nedostatečného účinku inzulínu. DM I. typu se může u jedince vyskytovat jako samostatné onemocnění nebo může být sdružen s jinými autoimunitními onemocněními, jako je právě celiakie. Rozvoj celiakie je podmíněn přítomností genetické predispozice, ale z větší části je ovlivněn vnějšími faktory, například enviromentálními. Genetická predispozice je vázána na alely HLA systému. Konkrétně se jedná o haplotypy HLA-DQ2 a HLA-DQ8. Onemocnění se vyznačuje rozdílnými klinickými příznaky, kvůli tomu je jeho diagnostika v některých případech velice obtížná a mnoho pacientů diagnostikováno vůbec není. Cílem teoretické části bakalářské práce bylo nastudování a následné shrnutí poznatků týkajících se onemocnění celiakie a diabetu mellitu I. typu (DMI). Z velké části se zde věnuji právě diabetu, celiakii a HLA systému. V případě celiakie jsem se zaměřila na její charakteristiku, diagnostiku, léčbu a její dědičnost. V případě diabetu jsem se zabývala jeho jednotlivými typy, léčbou a opět jeho genetickými predispozicemi. V závěru teoretické části popisuji samotný HLA systém a význam asociace DM I. typu s celiakií. Praktická část mé práce byla prováděna v genetické laboratoři GENLABS v Českých Budějovicích. Zde jsem se zabývala vyšetřením genetických predispozic k celiakii pomocí metody real-time PCR. Vyšetření je založeno na HLA typizaci rizikových alel, pomocí komerčně vyráběného kitu EliGene? Coeliac RT (DQ2, DQ8, DR4). Cílem praktické části bylo zvládnutí základních laboratorních metod jako je izolace DNA z periferní krve a bukálního stěru, měření koncentrace DNA, osvojení si metody real-time PCR, která slouží k určení rizikového HLA haplotypu a analýza získaných výsledků.
|
|
|
Genetické vyšetření HLA alel asociovaných k celiakii
SALZMANOVÁ, Kateřina
Celiakie je autoimunitní onemocnění, které je charakterizováno intolerancí gliadinu tvořící část lepku. Jeho nesnášenlivost vede k chronické zánětlivé odpovědi ve sliznici tenkého střeva s následnou malabsorpcí vyznačující se chronickým průjmem, tukovitou stolicí a neprospíváním. Celiakie je multifaktoriální onemocnění, podílí se na něm faktory vnějšího prostředí a genetické. Genetická predispozice je dána HLA alelami HLA-DQ2 (DQA1*05/DQB1*02) nebo DQ8(DQA1*0301/DQB1*0302) nebo HLA-DRB1*04. Toto onemocnění má řadu nespecifických klinických příznaků, proto většina pacientů není vůbec diagnostikována. Odhadovaný počet nemocných je až 50 000, avšak skutečnými pacienty je pouze 15 % z nich. Cílem teoretické části bakalářské práce bylo shrnout poznatky o celiakii a molekulárně genetických metodách založených na PCR, které se využívají při diagnostice predispozic k celiakii. V teoretické části o celiakii se zabývám hlavně popisem, formami, diagnostikou, patogenezí a nemocemi asociovanými s celiakií. Dále jsem se zabývala popisem a nomenklaturou HLA systému a jeho asociací s chorobami. V závěru teoretické části jsem se věnovala molekulárně genetickým metodám založených na PCR (PCR-SSP a RT-PCR). Praktickou část bakalářské práce jsem prováděla v genetické laboratoři na Zdravotně sociální fakultě, Zemědělské fakultě a v GENLABS, s.r.o. v Českých Budějovicích. Zabývala jsem se HLA typizací alel asociovaných s celiakií. Vyšetření jsem prováděla metodami PCR-SSP pomocí kitu HISTO TYPE Celiac Disease od firmy BAG Health Care a RT-PCR pomocí kitu EliGene? Coeliac RT (DQ2, DQ8, DRB4). Cílem práce bylo osvojit si správnou laboratorní praxi v genetické laboratoři. Dále zavést a zoptimalizovat komerčně dodávaný kit pro vyšetření HLA alel asociovaných s celiakií na principu PCR-SSP. Vyšetřit již vyšetřené pacienty metodou RT-PCR. Porovnat obě metody z hlediska shody a náročnosti.
|
|
|
Involvment of PDA3 in oxidative stress response
Ženklová, Lucie ; Vokřál, Ivan (vedoucí práce) ; Jirkovský, Eduard (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Studentka: Lucie Ženklová Školitelé: Prof. Fabio Altieri Ph.D. a PharmDr. Ivan Vokřál, Ph.D. Název diplomové práce: Involvement of PDIA3 in oxidative stress response PDIA3 je členem rodiny protein disulfid isomeráz (PDI) a jedná se o protein, uplatňující se při odpovědi organismu na stres. Dále je zapojen do různých buněčných signálních drah a má v buňce nejrůznější funkce. Jeho nejznámější role je v endoplazmatickém retikulu, kde plní funkci hlavně při skládání a kontrole kvality glykoproteinů. Nicméně jeho existence byla popsána také v mnoha jiných buněčných kompartmentech, například v jádře, mitochondriích, na buněčném povrchu nebo v cytosolu, kde zasahuje do nejrůznějších procesů (fúze spermie s vajíčkem, negenomická odpověď na vitamín D3, příjem vápníku buňkou,transkripční faktor v jádře atd.). Zatímco v některých případech musí být mechanismus jeho působení potvrzen dalšími studiemi, četná pozorování potvrzují jeho účast v přenosu různých signálů z buněčného povrchu (např. kooperce se STAT proteiny) a v regulačních procesech v jádře. V nedávných studiích byla také potvrzena jeho zvýšená exprese při různých patologických procesech. Cílem naší práce bylo zjistit, jaká je úloha PDIA3 proteinu při...
|
|
|
Stanovení množství transkriptu bcr/abl u chronické myeloidní leukémie
PYTLOVÁ, Kamila
Tato bakalářská práce se v teoretické části zabývá onemocněním chronická myeloidní leukémie (CML), která tvoří asi 25% leukémií dospělého věku, s maximálním výskytem ve věkové skupině mezi 50 - 70. rokem života. S nízkou frekvencí se vyskytuje i u dětí a mladistvých. Chronická myeloidní leukémie je charakterizována přítomností hybridního genu bcr/abl, který vzniká v důsledku reciproké translokace t(9;22)(q34;q11) karyotypicky detekovatelné jako Ph chromozóm. Gen bcr/abl je typickým znakem CML sloužící k upřesnění diagnózy a sledování úspěšnosti léčby. Kvantifikace je prováděna buď jako relativní (častěji), kdy se množství fluorescence testovaného vzorku porovnává s množstvím fluorescence jiného genu, nebo absolutní, kdy množství DNA odečítáme z kalibrační křivky, která nám poskytne výsledek DNA o dané koncentraci. Cílem této práce je srovnat různé způsoby kvantifikace transkriptu bcr/abl. Snaha o kvantifikaci tohoto transkriptu probíhá již dlouhou dobu, zapojili se zde organizace z celého světa. Nejcitlivější metodou pro zjištění přítomnosti této aberace je reverzní transkriptázová polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) detekující transkript bcr/abl. Druhým cílem této práce je podat přehled problematiky a provést jeden ze způsobů relativní kvantifikace genu bcr/abl. Posledním cílem je seznámení se s managementem vzorků v laboratoři a verifikací a validací těchto metod.
|
|
|
Využití metody RT-PCR při studiu reakce rostlin řepky na stres chladem
HARENČÁK, Jan
Cílem této práce je zhodnotit míru exprese genu pro protein ze skupiny dehydrinů ERD10 a genu transkripčního faktoru ICE1 u řepky, které jsou potenciálně zapojené v reakci na stres chladem. Ačkoliv řepka poměrně dobře odolává chladovým podmínkám, v ČR patří právě chlad mezi důležité prvky snižující její výnosnost. Expresní analýza byla provedena metodou RT qPCR u rostlin odrůd Cadeli a Navajo, které byly vystaveny stresu chladem a vykazují odlišnou reakci na stres chladem.
|
|
|
Studium vlivu flavonoidních látek na expresi biotransformačních enzymů
Koucká, Kamila ; Moserová, Michaela (vedoucí práce) ; Mrízová, Iveta (oponent)
Flavonoidy patří do skupiny fenolických látek řadící se mezi sekundární metabolity rostlin, které jsou zastoupeny převážně v ovoci a zelenině. Tyto látky vykazují antioxidační a anti-kancerogenní účinky. Některé z nich mohou mít vliv na biotransformační enzymy, mezi něž se řadí i cytochromy P450, a mohou tak ovlivňovat metabolismus xenobiotik. V předkládané bakalářské práci byl studován vliv dihydromyricetinu na genovou expresi cytochromu P450 1A1, 1A2 a cytochromu b5 v játrech, plicích, ledvinách, tlustém a tenkém střevě laboratorního potkana. Tenké střevo bylo rozděleno na tři části, a to proximální, střední a distální. Nejprve byla provedena izolace celkové RNA za využití komerčně dostupného činidla a dále byla izolovaná RNA převedena na cDNA metodou reverzní transkripce. Nakonec byla využitím polymerasové řetězové reakce v realném čase (RT-PCR) stanovena relativní genová exprese sledovaných genů v orgánech potkanů premedikovaných dihydromyricetinem a potkanů kontrolních, nepremedikovaných, vůči referenčnímu genu β-aktinu. Bylo zjištěno, že ve většině orgánů dihydromyricetin neměl signifikantní vliv na expresi sledovaných genů. Ovšem signifikantní snížení genové exprese CYP1A1 a CYP1A2 bylo zaznamenáno v plicích. Naopak nárůst genové exprese byl zjištěn v ledvinách v případě CYP1A2 a cytochromu...
|
|
|
Srovnání vlastností buněčných linií rezistentních k ellipticinu, doxorubicinu a cisplatině
Černá, Tereza ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Eckschlager, Tomáš (oponent)
6 Abstrakt Neuroblastom je nejčastější solidní extrakraniální nádor dětského věku. I přes veškeré pokroky v onkologické diagnostice a terapii je léčba některých forem neuroblastomu stále obtížná. Jednou z největších komplikací chemoterapie je vznik lékové rezistence. Tato práce se zabývá vlivem cytostatik na expresi vybraných proteinů, které se mohou podílet na chemorezistenci lidské neuroblastomové buněčné linie UKF-NB-4 na proteinové úrovni i na úrovni genové exprese. Senzitivní linie UKF-NB-4 a od ní odvozené rezistentní linie UKF-NB-4CDDP , UKF-NB-4DOXO a UKF-NB-4ELLI byly vystaveny působení cisplatiny, doxorubicinu nebo ellipticinu po dobu 24, 48 a 72 hodin. Metodou Western blot bylo prokázáno, že cytostatika cisplatina, doxorubicin nebo ellipticin podaná senzitivní neuroblastomové buněčné linii UKF-NB-4 v množstvích, která jsou přidávána do kultivačního média rezistentních neuroblastomových linií pro udržování rezistence, indukují po 72 hodinové kultivaci v této buněčné linii expresi proteinu p53 a zároveň snižují množství retinoblastomového proteinu pRb. Rozdíly v expresi proteinu RAS, cytochromů P450 1A1, 3A4 a cytochromu b5 nebyly prokázány. Změny v expresi studovaných proteinů u rezistentních linií UKF-NB-4CDDP , UKF-NB-4DOXO a UKF-NB-4ELLI kultivovaných s a bez přídavku daného cytostatika nejsou...
|
|
|
Studium vlivu dihydromyricetinu na expresi cytochromu P450 1A1 v orgánech laboratorního potkana
Feriančiková, Barbara ; Moserová, Michaela (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Polyfenoly jsou jednou z nejpočetnějších skupin látek v rostlinné říši, jsou bohatě zastoupeny v ovoci, zelenině a v mnoha nápojích. Jsou součástí až 80% vyšších rostlin a proto je stále větší zájem znát i metabolismus těchto látek. Polyfenoly jsou obecně považovány za látky pozitivně působící. Nicméně je třeba se na ně dívat jako na látky cizorodé. Interagují s klíčovými enzymy I. fáze biotransformace jako jsou cytochromy P450. V předkládané bakalářské práci byl studován vliv dihydromyricetinu na indukci CYP1A1 v orgranismu laboratorního potkana, zejména v orgánech účastnících se metabolismu xenobiotik a to játry a tenkým střevem. Tenké střevo bylo rozděleno na tři části - proximální, střední a distální. Vyhodnocování bylo prováděno metodou polymerasové řetězové reakce v reálném čase (RT-PCR). Bylo zjištěno, že dihydromyricetin významně neovlivňuje genovou expresi CYP1A1 v játrech. Na druhou stranu, v proximální části tenkého střeva byl zaznamenán nárůst a ve střední části naopak mírný pokles exprese CYP1A1 na úrovni mRNA. (In Czech) Klíčová slova: dihydromyricetin, cytochrom P450 1A1, mRNA, RT-PCR
|
host ::
RSS.