|
|
Stanovení aktivity průmyslově významných enzymů produkovaných mikroorganismy izolovanými z potravinového odpadu
Lymarenko, Sofiia
Při zpracování potravinového odpadu hraje důležitou roli mikrobiom a enzymy, které produkuje. Bacillus licheniformis je jedním ze zástupců mikroflóry při kompostování a zdrojem průmyslově významných hydrolytických enzymů: proteas, lipas a celulas. V rámci diplomové práce byla stanovována enzymatická aktivita pomocí spektrofotometrických metod u sedmi kmenů B. licheniformis izolovaných z potravinového odpadu po dobu 96 až 192 hodin. U všech sedmi kmenů byla prokázána celulasová, proteasová a lipasová aktivita, což se shoduje s dosud publikovanou literaturou. Nejvyšší celulasová aktivita stanovena dvěmi metodami byla zaznamenána u kmene 3A-52 (1 U/ml) a 1A-52 (1,5 U/ml) po 24 hodinách kultivace. pH optimum pro celulasovou aktivitu bylo 7, a teplotní optimum 50 °C až 60 °C. Maximální proteasová aktivita byla detekována později až po 120 a 144 hodinách kultivace u dvou kmenů: 3A-52 (1,3 U/ml) a 3D-42 (1,4 U/ml). Při provedení optimalizace se zjistilo, že pH optimum bylo 9 až 11 a teplotní optimum 40 až 45 °C v závislosti na kmenu. Maximální lipasová aktivita byla přibližně 0,7 U/ml a to po 144 hodinách kultivace u 4D-41 a 3D-42. Teplotní optimum bylo zjištěno při 50 až 60 °C a rozmezí pH optima pro tuto aktivitu bylo velice široké v závislosti na studovaném kmenu. U kmenů s nejvyšší enzymatickou aktivitou byla stanovená růstová křivka, kde nejvyšší celulasová aktivita odpovídala době přechodu bakteriální kultury z exponenciální fáze do stacionární, a nejvyšší lipasová a proteasová aktivita byla zjištěna později až při přechodu ze stacionární fáze do fáze odumírání. Kmeny 3A-52 a 3D-42 vykazovaly nejvyšší aktivitu u všech tří sledovaných enzymů. Následně tyto kmeny izolované při kompostování by mohly být použity pro produkci enzymů v průmyslu.
|
|
|
Study of the substrate specificity of the LACTB tumour suppressor enzyme
Baudyšová, Alžběta ; Kečkéšová, Zuzana (vedoucí práce) ; Janečková, Lucie (oponent)
Mitochondriální beta-laktamasa (LACTB) je nádorový supresor, jehož exprese způsobuje změny v metabolismu mitochondriálních fosfolipidů a indukuje diferenciaci nádorových buněk v buňky nerakovinné. Tento jev je způsoben down regulací fosfatidylserin dekaboxylasy (PISD), což následně vede ke snížení množství fosfatidyletanolaminů a lysofosfatidyletanolaminů v membráně mitochondrie. PISD ale není LACTB přímo štěpeno a tedy otázka, co je fyziologickým substrátem LACTB, zůstává stále nezodpovězená. Abychom se pokusili zaplnit tuto mezeru v našem poznání o mechanismech a funkci nádorového supresoru LACTB, byla tato diplomová práce zaměřena na nalezení substrátu LACTB pomocí proteomické analýzy PICS. Aby mohla být analýza provedena, bylo třeba nejprve vyizolovat rekombinantní wild-type LACTB a také LACTB se zrušeným katalytickým místem, zjistit, jaké je ideální in vitro prostředí pro práci s rekombinantním LACTB a také jaké podmínky jsou nutné pro to, aby LACTB tvořila multimery. Mé výsledky ukázaly, že aktivita LACTB in vitro stoupá se zvyšujícím se pH a také po přidání vápníku. Také jsem ukázala, že monomery LACTB v multimerních formách jsou spojeny disulfidickými můstky a že se tyto multimery rozpadají po přidání dithiothreitolu. Nejzajímavějším výsledkem práce byl poznatek, že LACTB je svým vlastním...
|
|
|
Proteasa Sapp3p patogenní kvasinky Candida parapsilosis
Sochor, Richard ; Heidingsfeld, Olga (vedoucí práce) ; Zábranská, Helena (oponent)
Patogenní kvasinky rodu Candida mohou způsobovat systémová onemocnění, která mohou u pacientů trpících imunosupresí v důsledku nějakého onemocnění, jako je například onemocnění AIDS, způsobovat závažné patologické stavy, které mohou vést až k úmrtí pacienta. Jednou takovou kvasinkou je patogenní kvasinka Candida parapsilosis. Pro kolonizaci hostitelských tkání a průniku do organismu využívá tato kvasinka různou škálu virulentních faktorů. Jedním z těchto virulentních faktorů jsou aspartátové proteasy. V patogenní kvasince C. parapsilosis se nachází tři aspartátové proteasy Sapp1p, Sapp2p a Sapp3p, které jsou paralogy. První dvě aspartátové proteasy jsou zodpovědné za zvýšení virulence kvasinky C. parapsilosis. Napomáhají kvasince přežívat v organismu degradací důležitých složek imunitního systému hostitele. Sapp3p ovšem tyto vlastnosti nevykazuje, kromě toho, že v určité míře napomáhá kvasince k adhezi na abiotické povrchy. Tato práce je zaměřena na objasnění funkce a lokalizace Sapp3p v kvasince C. parapsilosis. Pro objasnění funkce byl rekombinantně připraven prekurzor Sapp3p (pro- Sapp3p) v buňkách E. coli. U takto připraveného proteinu byla dále testována jeho autokatalytická aktivace a asistovaná aktivace pomocí trypsinu a Kex2p proteasy, za různých podmínek. Za zvolených podmínek se...
|
|
|
Role WSS1 proteasy v DNA reparačních procesech kvasinkové buňky.
Adámek, Michael ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Zachování integrity DNA je v průběhu života kritické pro každý živý organismus. Organismy si proto vyvinuly mnoho způsobů, jak detekovat a opravit různé typy poškození DNA, způsobené endogenními i exogenními vlivy, vyúsťující dále v replikační stres. Chyby v těchto opravných mechanismech mohou vést k závažným lidským onemocněním, jako jsou neurologické poruchy, familiární druhy onkologických onemocnění nebo vývojové syndromy. V této diplomové práci byla zkoumána funkce kvasinkového proteinu Wss1, metaloproteasy, která se podílí na nedávno objevené DNA opravné dráze, která proteolyticky odstraňuje proteiny kovalentně zachycené na zuje silnou negativní interakci s jinou proteasou opravující DNA, Ddi1, přičemž bylo objeveno, že kvasinkový kmen postrádající současně geny je hypersenzitivní na hydroxyureu. Hydroxyurea inhibuje ribonukleotidreduktasu, čímž v konečném důsledk způsobuje zastavení buňky v fázi buněčného cyklu. V rámci této diplomové práce byly na základě předchozích studií provedeny tzv. "rescue" experimenty s různými variantami Wss1, postrádajícími jednotlivé domény či obsahujícími bodové aminokyselinové záměny. Tyto experimenty následně posloužily k posouzení účasti jednotlivých domén proteinu Wss1 v odpovědi na replikační stres vyvolaný hydroxymočovinou.
|
|
|
Příprava rekombinantního kathepsinu C z krevničky střevní
Illichová, Hana ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Martínková, Markéta (oponent)
Krevničky rodu Schistosoma způsobují závažné parazitární onemocnění schistosomózu v oblastech tropů a subtropů. Kathepsin C (EC 3.4.14.1) je trávicí cysteinová proteasa krevniček, která se svou dipeptidylaminopeptidasovou aktivitou účastní degradace hemoglobinu z krve hostitele. Tento enzym je pro metabolismus krevniček nezbytný a představuje potenciální molekulární cíl pro vývoj chemoterapeutik pro léčbu schistosomózy. Kathepsin C krevniček nebyl dosud detailně studován a bakalářská práce se soustředí na vývoj expresních systémů pro produkci rekombinantního kathepsinu C ze Schistosoma mansoni (SmCC). V kvasinkách Pichia pastoris byl SmCC exprimován ve formě inaktivního prekurzoru (zymogenu) a byla analyzována jeho proteolytická stabilita. Dále byl připraven expresní systém v prvokovi Leishmania tarentolae, pro který byly navrženy čtyři odlišné konstrukty umožňující optimalizovat produkci SmCC.
|
|
|
Nestrukturní proteiny virů Zika a Dengue s enzymovou aktivitou.
Krýsová, Eliška ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Novotný, Marian (oponent)
Viry Zika a Dengue kódují vlastní enzymy, které jsou aktivní v různých stádiích replikačního cyklu. NS3, NS5 protein a jejich kofaktory hrají nepostradatelnou roli ve fungování flavivirů. I když byly struktury těchto proteinů již vyřešeny, jejich vlastnosti jsou prozkoumány jen částečně a mnoho aspektů ohledně jejich funkce zůstává nevyřešeno. Hlavními tématy této práce je úloha NS3 a NS5 proteinu v životním cyklu virů Zika a Dengue, sestřih polyproteinového prekurzoru, samotná replikace a interakce těchto enzymů s dalšími strukturními a nestrukturními proteiny. NS3 a NS5 protein mají mnoho enzymatických aktivit strukturně i funkčně oddělených, což je činí zajímavými z hlediska výzkumu autoaktivace, interakce funkčních domén a proteinů mezi sebou. Jelikož jsou infekce viry Zika a Dengue stále velmi vážným problémem, je nezbytné co nejlépe pochopit molekulární mechanismy jejich replikace. Klíčová slova: proteasa, polymerasa, Zika, Dengue, sestřih polyproteinů, protivirová terapie
|
|
|
Regulace aktivity katepsinu K pomocí reaktivních inhibičních molekul využitelných v biomedicíně
Benýšek, Jakub ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Obšilová, Veronika (oponent) ; Kutil, Zsófia (oponent)
2 Abstrakt Lidský katepsin K (KatK) je lysozomální cysteinová proteasa exprimovaná především v osteoklastech. Fyziologická funkce spočívá v degradaci extracelulární kostní matrix, kde je nejúčinnějším enzymem pro štěpení kolagenu. Zvýšená enzymatická aktivita KatK je spojena s osteoporózou a dále revmatoidní artritidou a osteoartritidou. Proto je KatK cílovou molekulou pro léčbu uvedených patologií a k jeho regulaci jsou vyvíjena chemoterapeutika na bázi proteasových inhibitorů. Tato práce se zabývá reaktivními peptidomimetickými a nízkomolekulárními inhibitory KatK typu thiadiazolů, vinylketonů a cyanohydrazidů. Soustředí se zejména na určení vazebného módu selektivních inhibitorů a charakterizaci jejich interakcí s aktivním místem KatK. Přístupy rentgenostrukturní analýzy jsou kombinovány s výpočetní chemií, enzymologickou analýzou a buněčnými testy k objasnění vztahu mezi strukturou a biochemickou aktivitou těchto inhibitorů. Získané výsledky přinášejí významné informace pro navrhování a optimalizaci nových vysoce účinných a selektivních inhibitorů KatK určených pro vývoj potenciálních léčiv a diagnostických sond. Klíčová slova: katepsin K, proteasa, inhibitor, 3D struktura, osteoporóza
|
|
|
Proteolytické enzymy krevničky střevní (Schistosoma mansoni): patobiochemie a využití v biomedicíně
Leontovyč, Adrian ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Kašný, Martin (oponent) ; Mikeš, Libor (oponent)
Krevní motolice rodu Schistosoma způsobují závažné parazitární onemocnění schistosomózu, které postihuje celosvětově přes 250 milionů lidí a představuje spolu s malárii nejvýznamnější parazitózy. Vzhledem k nebezpečí vzniku rezistence k jedinému používanému léku jsou intenzivně hledány nové způsoby terapie schistosomózy. Proteolytické enzymy krevniček jsou klíčové pro jejich přežití v hostiteli, a proto jsou slibnými cílovými molekulami pro vývoj nových chemoterapeutik a vakcín. Tato práce se zabývá dvěma proteasami z krevničky střevní (Schistosoma mansoni), které byly připraveny jako rekombinantní proteiny a komplexně funkčně charakterizovány. První z nich je serinová proteasa SmSP2, která je lokalizovaná na povrchu dospělců a sekretovaná do krve hostitele. Byla identifikována jako vasodilatační a fibrinolytický faktor a navržena její modulační role při interakci parazita s hostitelem. Druhou zkoumanou proteasou je cysteinový katepsin SmCL3, který se účastní trávení hostitelských krevních proteinů sloužících krevničkám jako zdroj živin. Byly identifikovány účinné peptidomimetické inhibitory SmCL3, u nichž byla prokázána antischistosomální aktivita v testech s živými parazity. Disertační práce přináší nové významné poznatky o proteasách krevničky S. mansoni, jejich patobiochemii a inhibiční...
|
|
|
BIOPHYSICAL AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF DDI1-LIKE ASPARTIC PROTEASES INVOLVED IN REPLICATION STRESS RESPONSE
Svoboda, Michal ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Čermák, Lukáš (oponent)
Bezchybná a včasná replikace molekul DNA je jedním z rozhodujících momentů životního cyklu každého organismu. Jakýkoliv defekt, ať už v časování či lokalizaci, může tento delikátní, na přesnosti závislý mechanismus uvrhnout do stavu takzvaného replikačního stresu. Některé z překážek blokujících postup replikační vidličky obsahují proteinovou složku. V průběhu evoluce se tak vyvinuly specializované proteasy, zodpovědné právě za uvolňování replikačního stresu. Kompletní paleta těchto proteolytických enzymů, stejně jako jejich substrátový repertoár a detailní molekulární mechanismus jejich zapojení v obraně proti DNA replikačnímu stresu však dosud nebyly objasněny. Tato disertační práce se zabývá rolí evolučně konzervovaných aspartátových proteas z rodiny proteinů podobných Ddi1 v proteolytické odpovědi na DNA replikační stres. V této práci byly strukturně a biofyzikálně charakterisováni členové rodiny Ddi1 podobných proteinů kvasinkového a lidského původu, byly prozkoumány jejich interakce s ubikvitinem, stejně jako s polyubikvitinovými řetězci. V neposlední řadě byla též mutantního kvasinkového kmene, který vedle genu pro DDI1 postrádá také gen pro DNA aktivovanou metalloproteasu WSS1, identifikována přecitlivělost na hydroxymočovinu, známý inhibitor replikace DNA. Detailní rozbor role kvasinkové...
|
|
|
Study of the substrate specificity of the LACTB tumour suppressor enzyme
Baudyšová, Alžběta ; Kečkéšová, Zuzana (vedoucí práce) ; Janečková, Lucie (oponent)
Mitochondriální beta-laktamasa (LACTB) je nádorový supresor, jehož exprese způsobuje změny v metabolismu mitochondriálních fosfolipidů a indukuje diferenciaci nádorových buněk v buňky nerakovinné. Tento jev je způsoben down regulací fosfatidylserin dekaboxylasy (PISD), což následně vede ke snížení množství fosfatidyletanolaminů a lysofosfatidyletanolaminů v membráně mitochondrie. PISD ale není LACTB přímo štěpeno a tedy otázka, co je fyziologickým substrátem LACTB, zůstává stále nezodpovězená. Abychom se pokusili zaplnit tuto mezeru v našem poznání o mechanismech a funkci nádorového supresoru LACTB, byla tato diplomová práce zaměřena na nalezení substrátu LACTB pomocí proteomické analýzy PICS. Aby mohla být analýza provedena, bylo třeba nejprve vyizolovat rekombinantní wild-type LACTB a také LACTB se zrušeným katalytickým místem, zjistit, jaké je ideální in vitro prostředí pro práci s rekombinantním LACTB a také jaké podmínky jsou nutné pro to, aby LACTB tvořila multimery. Mé výsledky ukázaly, že aktivita LACTB in vitro stoupá se zvyšujícím se pH a také po přidání vápníku. Také jsem ukázala, že monomery LACTB v multimerních formách jsou spojeny disulfidickými můstky a že se tyto multimery rozpadají po přidání dithiothreitolu. Nejzajímavějším výsledkem práce byl poznatek, že LACTB je svým vlastním...
|
host ::
RSS.