|
|
Biotechnologické produkce polyhydroxyalkanoátů svyužitím extrémofilních purpurových bakterií
Rubanová, Blanka ; Samek, Ota (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená diplomová práce se zabývá studiem metabolismu polyhydroxyalkanoátů (PHA) u extrémofilních purpurových bakterií, konktrétně bakterií Rhodoblastus acidophilus a Rhodobaca barguzinensis. Schopnost bakterií syntetizovat PHA byla zkoumaná při kultivaci v různých médiích a při využití různých zdrojů uhlíku. Nejprve byly určeny nejvhodnější podmínky (objem média, přítomnost světla, doba kultivace) pro kultivaci inokula. Následně byl pomocí plynové chromatografie zkoumán obsah PHA v bakteriích kultivovaných v různých médiích a za přídavku různých zdrojů uhlíku. Pro lepší charakterizaci metabolismu a morfologie bakterií byly dále použity metody skenovací transmisní elektronové mikroskopie (STEM) a infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR). Schopnost bakterií syntetizovat PHA byla zkoumána i na úrovni genotypu, a to metodou polymerázové řetězové reakce (PCR). V bakteriální DNA byla detekována přítomnost genu phaC, který kóduje PHA syntázu I. třídy. Dále byl proveden experiment, při kterém byly bakterie kultivovány v podmínkách příznivých pro syntézu mikrobiálních pigmentů (karotenoidy a bakteriochlorofyl a). Absorpční spektrum extrahovaných pigmentů bylo měřeno pomocí UV-VIS spektroskopie.
|
|
|
Study on metabolism of thermophillic bacterium Caldimonas thermodepolymerans
Krempaská, Vladimíra ; Sedlář, Karel (oponent) ; Buchtíková, Iva (vedoucí práce)
Microbial polyesters such as polyhydroxyalkanoates (PHAs) can serve as intracellular carbon and energy reserves for cells. One of the main advantages of PHAs is their biodegradability and biocompatibility, making them a potential partial replacement for traditional petrochemical plastics. However, their biotechnological production remains costly, and alternative methods are being sought to reduce process costs. The use of extremophilic microorganisms, like the thermophilic bacterium Caldimonas thermodepolymerans, is a promising possibility. This bacterium can process carbohydrates, which are abundant in lignocellulosic waste. In this study, the metabolism of three lignocellulosic carbohydrates (xylose, glucose, and cellobiose) and their combinations were investigated for the DSM 15344 from the DSMZ-German Collection. The biomass PHA content was determined through CG-FID after cultivations on individual carbohydrate substrates. Finally, changes in carbohydrate substrates during cultivation were evaluated by RT-qPCR, focusing on selected xylF and gtsA genes. A preference for xylose and cellobiose as a substrate was observed in the studied DSM 15344 from the DSMZ-German Collection.
|
|
|
Charakterizace vybraných bakteriálních kmenů získaných během evolučních experimentů
Hrabalová, Vendula ; Sedláček, Petr (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená diplomová práce se zabývá použitím evolučního inženýrství na bakteriální kmeny produkující polyhydroxyalkanoáty (PHA). Cílem této práce byla charakterizace adaptovaných bakteriálních kmenů na vybrané selekční tlaky. Pro evoluční experimenty byly vybrány dvě bakterie, Cupriavidus necator H16 a Halomonas halophila. Selekční tlaky, kterými se působilo na bakterie byly měďnaté kationty (Cu2+) a chlorid sodný (NaCl) pro C. necator H16, a kyselina octová (AA) a levulová (LA) pro H. halophila. Adaptované kmeny byly v průběhu dlouhodobých evolučních experimentů charakterizovány co do obsahu PHA a jeho Mw pomocí analýz GC-FID a SEC-MALS. Dále byl studován růst jednotlivých adaptovaných kmenů měřením optické hustoty. Pomocí spektrálního FC byla následně změřena procenta živých buněk po vystavení bakterií vybraným stresovým faktorům. Byly stanoveny specifické enzymové aktivity vybraných enzymů citrátového a glyoxalátového cyklu, enzymů generujících NADPH, enzymu zapojeného do metabolismu LA a enzymů biosyntézy PHA. U všech experimentů byly adaptované kmeny porovnávány s kmeny divokými. Optimální adaptace se projevila u bakterie C. necator H16 na Cu2+. Bakterie H. halophila byla na závěr kultivována v hydrolyzátu z lignocelulózových odpadů, kdy bylo zjištěno, že adaptovaný kmen H. halophila na LA je schopen produkovat více PHA než kmen původní.
|
|
|
Kyselina octová jakožto vedlejší produkt metabolismu bakterií produkující PHA
Ryšavá, Lenka ; Obručová,, Hana (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená bakalářská práce je zaměřena na experimentální studium produkce kyseliny octové jakožto vedlejšího produktu metabolismu bakterií produkující PHA. Praktická část této bakalářské práce se zabývá vlivem přidaného substrátu do média na nárůst biomasy, na produkci PHA a na tvorbu organických kyselin u kmenů, které potenciálně nacházejí své uplatnění při průmyslové produkci PHA – Cupriavidus necator H16, Burkholderia sacchari, Burkholderia cepacia. Nejvyšších výtěžků organických kyselin bylo dosaženo u bakterie Burkholderia sacchari při kultivaci na minerálním médiu s glukózou jako substrátem. Následující část práce je zaměřena na stanovení viability mikroorganismů pomocí průtokové cytometrie, kde bakterie Cupriavidus necator H16, Burkholderia sacchari, Burkholderia cepacia byly vystaveny vybraným stresovým faktorům.
|
|
|
Vliv schopnosti akumulace PHA na odolnost bakterií vůči bakteriocidním léčivům
Hrabalová, Vendula ; Kučera, Dan (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá vlivem bakteriocidních léčiv na bakterii kmene C. necator H16 a jejímu mutantnímu kmenu PHB-4. Kmen H16 je schopen akumulace polyhydroxyalkanoátů (PHA) ve formě granulí, zatímco kmen PHB-4 tuto schopnost postrádá. Teoretická část bakalářské práce se zaměřuje na vliv antibiotik na bakterie obecně a možností stanovení citlivosti mikroorganismů vůči antimikrobiálním látkám. V experimentální části byl testován vliv tří vybraných antibiotik (nisin, streptomycin a penicilin) na oba kmeny. Stanovena byla viabilita bakterií pomocí plotnové metody a průtokového cytometru. Dále byly použity antimikrobiální testy, konkrétně agarová difúzní metoda a bujónová diluční metoda. Ukázalo se, že produkce PHA snižuje odolnost buněk vůči antimikrobiálním látkám, protože kmen C. necator H16 je citlivější vůči působení streptomycinu a penicilinu než kmen C. necator PHB-4.
|
|
|
Biodegradabilita přirozených a modifikovaných polyesterů bakteriálního původu a jejich kompozitů
Pala, Martin ; Babák, Libor (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená práce se zabývala studiem biodegradability přirozených a modifikovaných polyesterů bakteriálního původu a jejich kompozitů. První část práce byla zaměřena na studium vlivu struktury PHA granulí na jejich biodegradabilitu pomocí vybraných enzymů a vliv fyziologických podmínek na stabilitu PHA. Celkově se zdá, že testovaný polymer, ať už v krystalické nebo amorfní formě je rezistentní vůči ataku použitých hydrolytických enzymů jako jsou lipáza nebo proteáza a je stabilní v simulovaných fyziologických prostředích. Díky tomu je možné uvažovat o využití PHA materiálů v biomedicínských aplikacích jako jsou například implantáty, které vyžadující spíše rezistentní materiály. Druhá část práce se zabývala mikrobiální degradací modifikovaných PHA materiálů s ohledem na jejich možný environmentální dopad. Na biodegradaci byla použita směsná termofilní kultura používáná v čističce odpadních vod a bakterie Delftia acidovorans. Byla testována biodegradabilita kompozitů obsahujících chlorovaný PHB a PHB fólií modifikovaných pomocí plastifikátorů. S rostoucím obsahem chlorovaného materiálu fólie vykazovaly spíše inhibiční efekt na růst biomasy obou testovaných kultur. Nejyšší míra degradace byla zaznamenána v přitomnosti bakteriální kultury u fólie obsahující 10% chlorovaného PHB (31%). Z výsledků lze konstatovat, že důležitým faktorem ovlivňující biodegradabilitu materiálů je použitá mikrobiální populace.
|
|
|
Využití bakterie Tepidimonas taiwanensis k produkci polyhydroxyalkanoátů na odpadních substrátech
Vidláková, Michaela ; Pernicová, Iva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená diplomová práce je zaměřena na screening produkce PHA pomocí termofilní bakterie Tepidimonas taiwanensis a na studium možného využití hroznových výlisků, melasy a odpadního papíru jako levných uhlíkatých substrátů pro kultivace charakterizované bakterie. Nejprve bylo provedeno testování základních kultivačních parametrů zahrnujících koncentraci uhlíkatého substrátu, dostupnost kyslíku, schopnost utilizace zdrojů dusíku a vybraných disacharidů. Produkce PHA z odpadních substrátů byla testována třemi způsoby. Při prvním byly jako zdroj uhlíku použity předem připravené hydrolyzáty z odpadních surovin zbavené pevného podílu. Druhý a třetí postup byl proveden nadávkováním odpadních materiálů přímo do minerálních médií, která se lišila pouze přítomností a absencí enzymového preparátu umožňujícím enzymatickou hydrolýzu dané suroviny za vzniku fermentovatelných sacharidů. Nejintenzivnější nárůst kultury a nejvyšší produkce PHA byla zaznamenána na hydrolyzátu z hroznových výlisků. Koncentrace biomasy u tohoto vzorku dosahovala až 4,8 g/l s obsahem 59 % PHA. Přídavek hroznových výlisků přímo do produkčního média se naopak vůbec neosvědčil, což bylo pravděpodobně způsobeno přítomností velkého množství inhibičních látek z výlisků. Podobně tomu bylo i u melasy a odpadního papíru, kdy byla bakterie Tepidimonas taiwanensis schopna růstu a případné produkce PHA pouze v malé míře. V rámci práce se podařilo také charakterizovat vliv teploty a pH na aktivitu enzymového koktejlu Viscozyme L a určit teplotní a pH optimum PHA syntázy bakteriálního kmene Tepidimonas taiwanensis v buněčném lyzátu.
|
|
|
Stresová odolnost PHA akumulujících bakterií vůči podmínkám v gastrointestinálním traktu
Kovářová, Radka ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá stresovou odolností bakterií produkující PHA vůči nepříznivým podmínkám v gastrointestinálním traktu. Za tímto účelem byly zvoleny dva bakteriální kmeny jako modelové mikroorganismy. Cupriavidus necator H16 produkující PHA a její mutantní kmen Cupriavidus necator PHB-4 bez schopnosti akumulace PHA. Pro experimentální část byly nejprve vybrány tři šťávy o různých koncentracích, konkrétně žaludeční, žlučová a pankreatická. Dále byla stanovována viabilita stresovaného bakteriálního kmene pomocí plotnové metody a průtokového cytometru. Mezi další využité metody patří antimikrobiální testy. První z těchto testů byla použita agarová difúzní metoda, díky které byly stanoveny a porovnány velikosti inhibičních zón. Poslední metoda, která byla provedena, je bujónová diluční metoda, sloužící k porovnání absorbancí čistých bakteriálních suspenzí a stresovaných suspenzích s danou šťávou o určité koncentraci. Z výsledků je patrné, že produkce PHA představuje v kontextu expozice stresovým podmínkám gastrointestinálního traktu především nevýhodu pro akumulující bakteriální kmen.
|
|
|
Využití PHA produkujících kmenů v bioremediačních technologiích
Šuráňová, Zuzana ; Sedláček, Petr (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem diplomové práce bylo studium využití PHA produkujících kmenů v bioremediačních technologiích. Pro tuto studii byly vybrány bakterie Pseudomonas putida KT2440 a dva izoláty z půdy zamořené ropou - Pseudomonas gessardii (D2) a Pseudomonas fulva (D3). V experimentální části byla studována především biodegradace odpadního peří pomocí testovaných mikrobiálních kmenů. Všechny testované bakterie vykazovaly biodegradační aktivitu vůči peří a byly jej schopny utilizovat jako jediný zdroj uhlíku. V průběhu biodegradačního procesu byl monitorován hmotnostní úbytek peří, aktivita proteáz a keratináz, koncentrace bakteriální biomasy, obsah PHA a také pH. Ukázalo se, že nejvyšších keratinázových aktivit i stupně degradace peří bylo dosaženo u bakterie Pseudomonas putida. Při kultivaci na odpadním peří žádná z testovaných bakterií neakumulovala detekovatelné množství PHA, nicméně biomasu nakultivovanou při biodegradaci peří je možné využít jako inokulum pro biotechnologickou výrobu MCL-PHA na odpadním oleji a kyselině oktanové. U bakterie Pseudomonas putida bylo v tomto experimentálním schématu dosaženo vysokého obsahu MCL-PHA v biomase - téměř 54% suché hmoty biomasy. V další části práce byla studována biodegradace nafty, ze studovaných bakteriálních kmenů bylo nejvyššího růstu biomasy, a tedy i biodegradačního potenciálu dosaženo u bakterie Pseudomonas fulva.
|
|
|
Evoluční inženýrství bakterií produkujících polyhydroxyalkanoáty
Nováčková, Ivana ; Kovalčík, Adriána (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá aplikací evolučního inženýrství na PHA produkující kmeny. Cílem práce je připravit prostřednictvím metod evolučního inženýrství kmeny adaptované na kyselinu levulovou, jakožto vybraný stresový faktor, a následně tyto kmeny charakterizovat. Teoretická část práce se zabývá především evolučním inženýrstvím a polyhydroxyalkanoáty. Pro evoluční experimenty byl využit bakteriální kmen Cupriavidus necator H16. Za účelem přípravy adaptovaných kmenů byla aplikována jednak samotná kyselina levulová, jednak kyselina levulová v přítomnosti mutagenu MMS. Selekce vhodných mutantů byla posuzována na základě růstového potenciálu a obsahu PHA v biomase. U pěti získaných PHA produkujících adaptovaných mutantů a kontroly byly prostřednictvím metod GC-FID, SEC-MALS, DSC a FT-IR charakterizovány vyizolované polymery. Bylo zjištěno, že vyšší obsah 3HV v kopolymeru vedl k nižší krystalinitě a tím i k nižší teplotě tání, z trendu se vymykal pouze kopolymer kmene M0151. Kromě charakteristik polymerů byly z biochemického hlediska posuzovány i samotné kmeny, a to prostřednictvím stanovování aktivit vybraných enzymů citrátového, glyoxalátového a 2-methylcitrátového cyklu, vybraných enzymů generujících NADPH, enzymu katabolismu kyseliny levulové a enzymů biosyntézy PHA. Na základě získaných dat byly diskutovány možné adaptační strategie, kdy se nejvíce odlišovat kmen E0575. Hodnoty specifických enzymových aktivit byly podrobeny metodám statistické analýzy AHC a PCA.
|
host ::
RSS.