|
|
Vývoj biofyzikální interpretace dat kvantitativního fázového zobrazování
Křížová, Aneta ; Jákl, Petr (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent) ; Chmelík, Radim (vedoucí práce)
Doktorská práce se zabývá biofyzikální interpretací dat kvantitativního fázového zobrazování (QPI – quantitative phase imaging) získaného pomocí koherencí řízeného holografického mikroskopu (CCHM – coherence-controlled holographic microscope). V práci jsou nejprve popsány metody vyhodnocující informace z QPI jako analýza tvarových a dynamických cha-rakteristik segmentovaných objektů a také vyhodnocování samotné fázové informace. Dále je navržena metoda dynamických fázových diferencí (DPD – dynamic phase differences), která umožňuje detailněji sledovat přesuny hmoty uvnitř buněk. Všechny uvedené metody jsou pak využity v biologických aplikacích. V rozsáhlé studii různých typů buněčných smrtí jsou informace z QPI porovnány s daty z průtokové cytometrie a s výhodou je využita kombinace QPI a fluorescenční mikroskopie. Metoda DPD je pak využita při studiu přesunů hmoty uvnitř buňky při osmotických jevech. Zjednodušená metoda DPD je aplikována při výzkumu mechanizmu pohybu nádorových buněk v kolagenových gelech.
|
|
|
Kritický přehled kultivačních zařízení používaných pro mikroskopická sledování živých buněk
Ukropcová, Iveta ; Štrbková, Lenka (oponent) ; Dostál, Zbyněk (vedoucí práce)
Koherencí řízený holografický mikroskop (CCHM) nachází své uplatnění především v mikroskopování živých buněk in vitro. Pozorované buňky musí být umístěny v kultivačním zařízení, které umožňuje kvalitní záznam hologramu. Metodou kvantitativního fázového zobrazení (QPI) jsou pozorovány živé buňky. Běžná kultivační zařízení většinou nejsou pro metodu QPI uzpůsobena. V textu jsou specifikovány požadavky na kultivační zařízení pro CCHM. Stěžejní částí práce je kritický přehled komerčně dostupných kultivačních zařízení a zhodnocení, zda tato zařízení specifikované požadavky splňují. Dále se tato práce zabývá problematikou mikrofluidiky a její aplikací v mikroskopickém sledování buněk. V poslední části práce jsou popsány dvě hybridní kultivační zařízení optimalizovaná pro CCHM, která umožňují mikrofluidické buněčné experimenty.
|
|
|
Motilita leukemických buněk analyzovaná nekoherentním holografickým kvantitativním zobrazováním fáze
Smrčková, Zuzana ; Škarková, Aneta (oponent) ; Zicha, Daniel (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá problematikou analýzy motility leukemických buněk. Kvantitativní analýzou motility buněk v tkáňové kultuře při použití časosběrného záznamu lze získat přesný popis vykonávaného pohybu buňky a detekovat odlišnosti v jejich pohybu za různých experimentálních podmínek. První část této práce popisuje jednotlivé způsoby migrace nádorových buněk. Druhá část je věnována metodám analýzy motility buněk v tkáňové kultuře při použití časosběrného záznamu, které zahrnují pořízení snímků a jejich zpracování. Součástí této kapitoly je popsán koherencí řízený holografický mikroskop, který byl v rámci této práce využíván a pro který byla navržena vložka zajišťující přesnou a stabilní polohu jednotlivých komůrek s buňkami. Poslední část je věnována samotnému výzkumu motility leukemických buněk, která je uzavřena diskusí nad získanými výsledky. V příloze je uvedena publikovaná studie s poděkováním autorce této diplomové práce za spoluúčast ve výzkumu.
|
|
|
Biofyzikální interpretace kvantitativního fázového zobrazení s využitím koherencí řízené holografické mikroskopie
Šuráňová, Markéta ; Rösel,, Daniel (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent) ; Veselý, Pavel (vedoucí práce)
Dizertační práce pojednává o biofyzikální interpretaci kvantitativního fázového zobrazování (QPI – Quantitative Phase Imaging) získaného pomocí koherencí řízené holografické mikroskopie (CCHM – Coherence-Controlled Holographic Microscopy) v provedení Q-PHASE mikroskop, Telight, Brno). Teoretická část této práce se zabývá charakteristikou kvantitativního fázového zobrazení, které poskytuje neinvazivní metodou informace o aktivitě živých buněk in vitro. Hlavní část práce spočívá ve vytvoření koncepce a ověření nové metody primárního kritického ohodnocení léků pro očekávaný anti-migrační/metastatický potenciál (PAMP – Primary Assessment of Migrastatic Potential). Výsledek této metody je prvním třídícím hodnocením při zvažování konkrétních migrastatických látek pro budoucí komplexní onkologickou léčbu. Hodnotí nejen růst nádorových buněk, rychlost pohybu buněk, ale i odhalení rizika nebezpečných invazivních fenotypů. Dále je navržena metoda korelační mikroskopie mezi Q-PHASE mikroskopem a laserovým skenovacím konfokálním mikroskopem (LSCM) pro účel hodnocení chování buněk a výskytu fokálních adhezí po aplikaci léčiv. Kvantitativní fázové zobrazení získané pomocí Q-PHASE mikroskopu je srovnáno s kvantitativním fázovým zobrazením z HoloMonitoru (PHI AB, Švédsko), na kterém je následně ověřena metody PAMP.
|
|
|
Koherencí řízený holografický mikroskop
Kolman, Pavel ; Křupka, Ivan (oponent) ; Kozubek, Michal (oponent) ; Chmelík, Radim (vedoucí práce)
Byl navržen, zkonstruován a ověřen koherencí řízený transmisní holografický mikroskop (CCHM) s mimoosovým achromatickým a prostorově invariantním interferometrem s difrakčním děličem svazku. Tento interferometr umožňuje zobrazení světlem plošného, časově i prostorově nekoherentního zdroje. Mimoosové holografické zobrazení předmětu je zaznamenáno a numericky je fourierovskými metodami rekonstruována komplexní amplituda předmětové vlny, tedy její intenzita a fáze. Fázové zobrazení představuje rozdíl optických drah mezi předmětovou a referenční větví způsobený vloženým předmětem. Jde tedy o kvantitativní fázový kontrast. Intenzitní zobrazení je při osvětlení prostorově nekoherentním zdrojem ekvivalentní zobrazení rastrovacím konfokálním mikroskopem. Lze tedy zobrazovat předměty překryté rozptylující vrstvou nebo vnořené v rozptylujícím prostředí. Při současném použití prostorově a časově nekoherentního osvětlení jsou optické řezy tenčí než v případě konfokálního mikroskopu. K rekonstrukci zobrazení stačí jediný snímek hologramu, což zaručuje vysokou odolnost systému vůči rychlým změnám podmínek pozorování, zejména turbulencím okolního prostředí. Frekvence snímkování není omezena žádnou částí optické soustavy. Je omezena pouze rychlostí záznamového zařízení. Je tedy možné pozorování velmi rychlých dějů. V rámci koherenčního objemu lze mikroskop ex post numericky přeostřovat. Stupeň koherence osvětlení lze přizpůsobit charakteru vzorku a požadovaným vlastnostem zobrazení. Vyšší stupeň koherence osvětlení poskytuje možnost numerického přeostřování v osově rozsáhlejší oblasti. Omezení koherence tuto oblast zužuje a současně ztenčuje optický řez, potlačuje koherenční šum a umožňuje zobrazení pouze balistickým světlem. Kromě separace balistického světla umožňuje CCHM separovat také světlo difúzní. Paralelní holografický záznam obrazu v mnoha barvách v jediném okamžiku umožňuje v některých případech překonat destruktivní interferenci světla ve vzorku na některé vlnové délce a zachovat tím fázovou informaci z tohoto pozorovaného místa. Příčná rozlišovací schopnost odpovídá nekoherentnímu zobrazovacímu procesu a je dvojnásobná oproti rozlišovací schopnosti při koherentním osvětlení. Je popsáno optické uspořádání mikroskopu a jsou uvedeny podmínky, jejichž splněním se dosáhne achromatičnosti interferometru. Na základě zvolené metody rekonstrukce komplexní amplitudy zobrazení a na základě analýzy spektra prostorových frekvencí hologramu ve výstupní rovině interferometru je odvozena jedna z podmínek pro stanovení hustoty vrypů difrakčního děliče svazku. Je určena účinná spektrální propustnost mikroskopu, je pojednáno o vlivu vyšších difrakčních řádů na výsledné holografické zobrazení a o vlivu velikosti plošného zdroje na kontrast interferenčních proužků hologramu. Dále jsou odvozeny podmínky pro zvětšení a numerickou aperturu výstupního objektivu, je určena velikost zorného pole a ta je porovnána s běžným světelným mikroskopem. Součástí práce je výrobní výkresová dokumentace mikroskopu. Podrobně je popsán způsob nastavení všech optických prvků mikroskopu, a to jak v průběhu montáže, tak při běžném provozu při výměně objektivů. Na zobrazení modelových vzorků jsou demonstrovány a diskutovány vlastnosti holografického zobrazení.
|
|
|
Konstrukční úpravy koherencí řízeného holografického mikroskopu
Matela, Milan ; Šerý, Mojmír (oponent) ; Kolman, Pavel (vedoucí práce)
Předmětem diplomové práce je konstrukční úprava koherencí řízeného holografického mikroskopu, která povede k odstranění některých nedostatků. V práci je stručně popsána historie interferenční mikroskopie a rozdíly mezi jednotlivými druhy interferenčních mikroskopů. Jsou také uvedeny konstrukční nedostatky současného stavu a navrhnuta řešení, která jsou stručně popsána. Následně je vybráno nejlepší řešení, které je upraveno do konečné podoby, je podrobně popsáno a následně je provedena i jeho realizace. V závěru práce je shrnuto, zda úpravy vyhovují a jestli splnily požadované podmínky.
|
|
|
Koherencí řízený holografický mikroskop nové generace
Slabý, Tomáš ; Novák,, Jiří (oponent) ; Jákl, Petr (oponent) ; Chmelík, Radim (vedoucí práce)
Dizertační práce se zabývá návrhem nové generace koherencí řízeného holografického mikroskopu (CCHM). Mikroskop je založen na mimoosovém holografickém uspořádání využívajícím difrakční mřížku a umožňuje použití časově i prostorově nekoherentního osvětlení. V teoretické části je navrženo nové optické uspořádání a odvozeny podmínky pro jednotlivé parametry mikroskopu a jeho komponent. Také je studován vliv různých zdrojů šumu na citlivost detekce fáze. V další části je popsán návrh laboratorní sestavy mikroskopu a navržen automatizovatelný seřizovací postup. Poslední část práce se zabývá experimentálním ověřením nejdůležitějších optických parametrů laboratorní sestavy mikroskopu. Oproti předchozí generaci CCHM nový návrh využívá objektivy korigované na nekonečnou tubusovou délku a běžné mikroskopové kondenzory, umožňuje zvětšení prostoru pro pozorované vzorky, odstraňuje omezení spektrální propustnosti a značně zjednodušuje seřizovací postup až na automatizovatelnou úroveň.
|
|
|
Identifikace změn chování nádorových buněk v nízkých koncentracích migrastatik koherencí řízeným holografickým mikroskopem
Zábranská, Magdaléna ; Netíková,, Irena Štenglová (oponent) ; Veselý, Pavel (vedoucí práce)
Předmětem diplomové práce bylo použití koherencí řízeného holografického mikroskopu ve výzkumu vlivu migrastatik v různých koncentracích na nádorové buňky a interpretace dat kvantitativního fázového zobrazení. Teoretický úvod je rozdělen na dvě části. První část je věnována CCHM, kde je stručně popsána historie holografické mikroskopie, princip a detailní popis hlavních částí mikroskopu. Druhou částí je úvod do problematiky nádorové léčby a představení migrastatických léčiv. Experimentální částí práce je analýza vlivu migrastatik na dvě nádorové linie (H1299 a HT1080) z naměřených časosběrných záznamů pořízených holografickým mikroskopem. Vliv léčiv byl vyhodnocen pomocí charakteristik popisující morfologické a dynamické změny buněk v softwaru SophiQ. Data byla následně graficky a statisticky zpracována s cílem srovnání a vyhodnocení účinku migrastatik v nízkých koncentracích. V závěru práce byly shrnuty získané poznatky a navrhnuty vybrané charakteristiky k analýze vlivu migrastatik.
|
|
|
Průtokové komůrky pro mikroskopii živých buněk
Čolláková, Jana ; Ježek, Jan (oponent) ; Antoš, Martin (vedoucí práce)
Byla navržena a zkonstruována průtoková komůrka pro dlouhodobé pozorování živých buněk v transmisním, koherencí řízeném holografickém mikroskopu (CCHM), který byl vyvinut v Laboratoři experimentální biofotoniky na Ústavu fyzikálního inženýrství VUT v Brně. CCHM umožňuje vyhodnocovat dynamické změny uvnitř živé buňky díky kvantitativní informaci o fázovém posuvu pro každý obrazový bod. Aby se experimentálně prokázaly výhody CCHM, je důležité dlouhodobě udržovat optimální kultivační podmínky přidáváním čerstvého kultivačního média pro pozorované buňky přímo v mikroskopu. Průtoková komůrka umožňuje jak výměnu kultivačního média, tak aplikaci biologických činidel bez nutnosti vyjmutí komůrky z mikroskopu, jak je tomu u stacionárních komůrek. Můžeme tak sledovat životní projevy před aplikací činidel a reakci buněk po aplikaci. Na základě publikací s řešenými návrhy průtokových komůrek, uvedených v předložené diplomové práci, byl realizován originální průtokový systém s příslušenstvím, vyhovující konstrukčnímu řešení CCHM. Byly rovněž diskutovány vlastnosti proudění a proces výměny kapalin v průtokové komůrce a na základě provedených simulací byl modifikován tvar vnitřního prostoru komůrky. Funkčnost a použitelnost průtokové komůrky byla experimentálně prokázána v CCHM i v jiných mikroskopech. V navržených průtokových komůrkách byly úspěšně pozorovány reakce nádorových a epiteliálních buněk na změnu prostředí z kultivačního média na fyziologický roztok.
|
|
|
Analýza změn fenotypu nádorových buněk navozených migrastatiky v kvantitativním fázovém zobrazení
Kolínková, Veronika ; Netíková,, Irena Štenglová (oponent) ; Veselý, Pavel (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zaměřuje na pozorování živých buněk pomocí neinvazivní metody kvantitativního fázového zobrazování (hiQPI). Takové zobrazení je umožněno pomocí koherencí řízeného holografického mikroskopu (CCHM) vyvinutého v laboratoři experimentální biofotoniky na VUT. Pomocí této zobrazovací technologie jsou v rámci experimentální části práce vyhodnoceny morfologické změny nádorových buněk A549 a MCF7 po aplikaci potenciálních migrastatik. Jako migrastatika jsou označována již schválená léčiva, která by mohla zamezit migraci nádorových buněk z primárního nádoru a tím předejít vzniku metastáz. Pro posouzení jejich účinku na nádorové buňky byla zvolena metoda RAC-GM (Rychlé vyšetření růstu a migrace buněk in vitro).
|
host ::
RSS.