|
|
Heterologní exprese a purifikace potkaní formy cytochromu P450 1A1
Vlková, Michaela ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
Cytochrom P450 1A1 patří do "superrodiny" cytochromů P450 (CYP). Je to extrahepatální enzym, který se podílí na detoxikačním metabolismu mnoha xenobiotik, ale bohužel také zároveň patří mezi nejvýznamnější zástupce CYP účastnící se aktivace prokarcinogenů. Hlavním cílem této práce bylo pomocí heterologní exprese připravit a izolovat potkaní cytochrom P450 1A1 v dostatečném množství a čistotě. V rámci této práce byly připraveny dva vektory nesoucí gen pro potkaní cytochrom P450 1A1 vložené do účinného expresního plasmidu pCW. Funkčnost připravených vektorů byla ověřena expresí CYP1A1 a měřením CO diferenčních spekter. Zjistilo se, že pouze jeden z vektorů poskytoval nativní protein. Tento vektor byl transformován do buněk bakterií E.coli kmene DH5α, DH5α s vneseným plasmidem pHg1 a DH5α s vneseným plasmidem pGRO7. Byly testovány různé podmínky produkce CYP1A1: růstová média (LB a TB médium), čas produkce (24 a 48h), koncentrace IPTG (0,5mM a 1mM) a přítomnost ALA. Nejvyšší exprese bylo dosaženo v buňkách E.coli DH5α kultivovaných v modifikovaném TB médiu po 48 hodinách exprese a při teplotě 30řC (indukce při 0,6 - 0,8 OD600 0,5mM IPTG s přídavkem 0,5mM ALA). Úspěšně se podařilo exprimovat také CYP1A1 bez ALA za pomocí plasmidu pHg1, což velmi sníží ekonomické náklady celé produkce. Membrány buněk...
|
|
|
Příprava rekombinantního cytochromu P450 1A1
Dvořák, Martin ; Svášková, Dagmar (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
4 Abstrakt Cytochrom P450 1A1 (CYP1A1) je jednou z hlavních isoforem z celé "superrodiny" cytochromů P450 (CYP). Jedná se zejména o extrahepatální enzym, který se podílí na oxidaci mnoha polycyklických aromatických uhlovodíků a jiných xenobiotik. Vedle úlohy v detoxifikačním metabolismu je bohužel CYP1A1 také jeden z nejvýznamnějších CYP v aktivaci prokarcinogenů. Cílem této práce bylo připravit pomocí genové syntézy s optimalizací kodónů pro expresi v E. coli dvě různé varianty genu kódujícího potkaní CYP1A1, tj. "wild type" (wt1A1) a s pozměněnou N-terminální kotvou (mod1A1) (u obou pak modifikace s nebo bez His kotvy na C-konci), porovnat jejich expresi v různých typech buněk E. coli a případně se pokusit o purifikaci a srovnání enzymové aktivity genových produktů. Z navržených oligonukleotidů byly syntetizovány 2 "syntony" (části genu), vloženy samostatně do plasmidu pUC19, po ověření sekvence "vyštěpeny", spojeny a vloženy do expresního plasmidu pET-22b. Takto připravenými vektory byly transformovány 3 kmeny buněk E. coli, a to BL-21 (DE3) GOLD, RIL a RIPL. Byly testovány různé podmínky produkce požadovaných proteinů: teplota (18, 22, 24, 27 a 37 řC), čas produkce (až 48 hodin), koncentrace IPTG (0,1; 0,2; 0,5 a 1mM), OD600 při indukci (0,4; 0,6; 0,8; 0,9 a 1) a přidání ALA (0, 30, 60, 120 nebo 150...
|
host ::
RSS.