|
| |
|
|
Studium faktorů ovlivňujících transport protonů transportním proteinem MntH.
Straková, Eva ; Urbánková, Eva (vedoucí práce) ; Žáčková, Markéta (oponent)
Proteiny z rodiny Nramp (Natural resistance-associated macrophage protein) představují sekundárně aktivní membránové transportéry napomáhající buňkám v přenosu dvojmocných kovových iontů (Mn2+, Fe2+, Cd2+, Co2+, Zn2+) přes biologické membrány. Bakteriální proteiny patřící do této rodiny, MntH (Proton-dependent Manganese Transporter), byly popsány jako transportéry manganu závislé na protonovém gradientu. V této práci byl použit homolog MntH z E. coli představující vhodný modelový systém pro studium vztahu strukturny a funkce. Transport protonů tímto proteinem indukovaný kovy byl měřen postupem stanovujícím změny vnitřního pH užitím pH citlivého fluorescenčního proteinu pHluorinu. Takto určenými změnami [H+] však nelze zjistit skutečné množství transportovaných protonů, protože buňka hodnotu vnitřního pH aktivně reguluje. Pro lepší kvantifikaci transportu byla měřena pufrační kapacita bakterií pomocí detekce změn pH po přidání kyseliny propanové. Pro transport protonů indukovaný kadmiem byly změny [H+] přepočítány přes pufrační kapacitu a to pro divoký typ MntH a jeho jednobodovou mutaci N401G, o níž je známo, že ovlivňuje vnitřní pH buněk. Bylo ukázáno, že způsob zpracování podstatně ovlivňuje výsledky a promítne se také do závislosti transportu na vnějším pH. Možný vliv kadmia na respiraci byl imitován...
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
|
Vnitřní pH kvasinek a vliv transportu draselných iontů na jeho regulaci
Hošková, Barbora ; Urbánková, Eva (vedoucí práce) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Cytosolické pH kvasinek je regulováno a udržováno na stálé hodnotě součinností mnoha transportních proteinů. V této diplomové práci bylo využito fluorescenčního proteinu pHluorinu citlivého k pH okolí pro studium cytosolického pH v Saccharomyces cerevisiae. Většina měření byla prováděna na spektrofluorimetru, ale pro možné budoucí měření byla optimalizována i metoda měření na readeru (možnost měřit více vzorků zároveň) a bylo využito arginin-fosfátového kultivačního média. Zprostředkovaně byl sledován vliv konkrétních delecí proteinů na regulaci a stabilitu pH cytosolu. Některé proteiny s regulací cytosolického pH souvisí přímo, jako např. Pma1 - H+-ATPáza, jiné nepřímo - např. Ypt6. Bylo prokázáno, že samotná hodnota pHcyt závisí nejen na použitém kmeni kvasinek, ale i na kultivačních a experimentálních podmínkách. Žádná ze studovaných delecí neovlivnila regulaci pH výrazně, buňky si zachovaly schopnost regulace i v případě okyselení vnějšího prostředí kyselinou sírovou. Pufrační kapacita, měřená metodou přidání slabé zásady k suspenzi buněk, se pohybovala v rozmezí 30 - 60 mM v případě kultivace buněk v YNB médiu. Při kultivaci v AP médiu byla pufrační kapacita větší.
|
|
|
Study of factors influencing the function of MntH, membrane transport protein of E. coli
Jurková, Ingrid ; Urbánková, Eva (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Protein MntH patřící do rodiny transportérů Nramp hraje důležitou roli nejen v homeostáze železa a manganu, ale i při obraně bakteriálních buněk před imunitní reakcí napadeného hostitele. Tento protein transportuje do buňky dvojmocné kovové ionty v symportu s protony, přičemž stechiometrie tohoto transportu se mění v závislosti na membránovém potenciálu a na extracelulárním pH. V první části této práce byl pomocí redistribuční potenciálové sondy diS-C3(3) zkoumán vliv exprese MNTH a transportu dvojmocných iontů přenašečem MntH na membránový potenciál buněk E. coli. Zjistili jsme, že buňky exprimující MNTH jsou hyperpolarizovány a jejich membránový potenciál se depolarizuje po přidání některých dvojmocných kovů. Ve druhé části práce jsme se věnovali teoretickému studiu kinetiky membránových přenašečů popsaných čtyř-, šesti- nebo osmistavovým transportním modelem, do něhož byla zavedena závislost všech rychlostních konstant na membránovém potenciálu. Pomocí matematického modelování byla zkoumána závislost toku přenašečem na různých parametrech transportního modelu, jako jsou například membránový potenciál, koncentrace substrátu nebo náboj substrátu či přenašeče. Byly pozorovány některé jevy, popisované i u proteinu MntH (proměnná stechiometrie transportu a její závislost na potenciálu a pH). Pro detailnější...
|
|
|
Studium vztahů mezi strukturou a funkcí C - konce vaniloidního receptoru TRPV1
Gryčová, Lenka ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Heřman, Petr (oponent) ; Urbánková, Eva (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
Vaniloidní receptor TRPV1 je neselektivní kationtový kanál, který je aktivován řadou podnětů, mezi které patří teplota, kyselé pH a množství chemických látek. Aktivita tohoto kanálu může být modulována i molekulami ATP a na jeho regulaci se podílí také kalmodulin. Přestože ATP přímo tento receptor neaktivuje, přítomnost intracelulárního ATP zvyšuje amplitudu proudu u již aktivovaných receptorů. Bylo prokázáno, že ATP přímo interaguje se ATP vazebnou doménou Walker A typu na cytoplazmatickém C- konci. Abychom identifikovali aminokyselinové zbytky, které se účastní vazby ATP na C- konec TRPV1, provedli jsme místně specifické bodové mutace oblasti Walker A motivu: P732A, D733A, G734A, K735A, D736A a D737A. S využitím metod fluorescenční spektroskopie TNP-ATP kompetičních experimentů a značení a zhášení fluorescence FITC jsme identifikovali K735 jako klíčové reziduum pro tuto vazbu. Experimentálně získané údaje byly interpretovány s ohledem na 3D počítačový model C- konce TRPV1 určující vazbu molekul ligandů. Kalmodulin je označován za jednu z významných molekul pro regulaci aktivity TRPV1. Přestože oblast C- konce TRPV1 interaguje s tímto proteinem, v sekvenci C- konce TRPV1 se nenachází žádný z klasických vazebných motivů pro kalmodulin. V této práci jsme detailně popsali tento, ne zcela typický, vazebný...
|
|
| |
host ::
RSS.