|
|
Role asparagin syntetázy v leukemických buňkách
Šafrhansová, Lucie ; Starková, Júlia (vedoucí práce) ; Čuřík, Nikola (oponent)
Tato diplomová práce se zaměřuje na detekci mutací enzymu asparaginsyntetázy na metabolismus leukemických buněk a roli tohoto enzymu v kontextu chemoterapie založené na podávaní L-asparaginázy. Experimentální část práce je rozdělená do dvou oddělených úseků. S ohledem na chybějící data sekvenace genu asparaginsyntetázy u leukemií, bylo prvním cílem zjistit, jestli v genu leukemický linií nejsou přítomny mutace, které by mohly mít vliv na funkci ASNS a hrát tak roli v rezistenci leukemických buněk vůči terapii ASNázou. Metodou sekvenování nové generace nebyly nedetekovány žádné mutace, které by mohly ovlivnit aktivitu enzymu. V druhé části byl vytvořen model RS4;11 který exprimuje ASNS. Poté byl studován vliv ASNS na glykolýzu citlivost těchto buněk vůči účinkům L-asparaginázy a k depleci asparaginu a glutaminu. Bylo pozorováno, že exprese ASNS zvyšuje úroveň glykolýzy a zvyšuje odolnost těchto buněk vůči depleci asparaginu a glutaminu a jejich rezistenci vůči asparagináze. Klíčová slova: ASNS, asparagin, leukemie, L-asparagináza, chemoterapie, rezistence
|
|
|
The clinical relevance of immunogenic cell death associated signalling and molecules in cancer therapy
Holíček, Peter ; Palich Fučíková, Jitka (vedoucí práce) ; Říhová, Blanka (oponent) ; Starková, Júlia (oponent)
Klinický význam molekul a procesů asociovaných s imunogenní buněčnou apoptózou v terapii nádorových onemocnění Schopnost nádorových buněk vyvolat protinádorovou imunitní odpověď závisí na mnoha faktorech, včetně antigenního profilu nádorových buněk a jejich schopnosti poskytovat adjuvantní signály ve formě molekul asociovaných s nebezpečím (DAMPs). Tyto molekuly jsou vystavovány a či uvolňovány během imunogenní buněčné smrti (ICD) a za určitých okolností mohou vést k aktivaci vrozené a adaptivní protinádorové imunitní odpovědi. Schopnost aktivovat ICD mají některá chemoterapeutika, fyzikální modality, cílená protinádorová léčba či radioterapie, které kromě vlastní cytotoxické aktivity na nádorové buňky mohou aktivovat klinicky relevantní protinádorovou imunitní odpověď. Z tohoto důvodu u pacientů s vrozenou poruchou v buněčné signalizaci vedoucí k uvolňování DAMPs může docházet ke snížené odpovědi na uvedený typ léčby. Předložená disertační práce se zejména zaměřuje na klinický význam procesů, které souvisí s imunogenní buněčnou smrtí a zkoumá vliv ICD na rozvoj vrozené protinádorové imunitní odpovědi se zaměřením na NK (z angl. Natural killer cells) buňky. Výsledky naší práce ukazují, že kalretikulin (ekto-CALR), jako klíčový ukazatel ICD, vystavený na povrchu nádorových buněk pozitivně ovlivňuje...
|
|
|
Cancer metabolism and its role in the sensitivity to ASNase of leukemic cells to L-asparaginase
Alquezar Artieda, Natividad ; Starková, Júlia (vedoucí práce) ; Procházka, Vít (oponent) ; Truksa, Jaroslav (oponent)
Cancer metabolism and its role in the sensitivity of leukemic cells to L- asparaginase ABSTRACT No ultimate treatment strategy exists for relapsed or non-responsive (15-20%) children with acute lymphoblastic leukemia (ALL). In this study, we aimed to elucidate the impact of metabolic rewiring in leukemic cells on poor therapy response and the emergence of resistance. This dissertation focuses on l-asparaginase (ASNase), a crucial chemotherapeutic agent and its effect on leukemia, using models of leukemic cell lines and primary cells of ALL patients. Cell metabolism was assessed by measuring metabolic pathways and nutrient influx using a Seahorse analyzer and stable isotope tracing. Main findings of the study demonstrated that the ASNase- therapy response was mitigated by the activity of the mechanistic target of rapamycin (mTOR)- regulated biosynthetic pathways. This phenomenon was induced by the bone marrow environment, which enabled the activation of the resistant mechanism in leukemic cells. We next found a correlation between the following metabolic features and lower sensitivity to ASNase: low ATP- linked respiration, high mitochondrial membrane potential and high glycolytic flux before therapy. The latter was shown to have prognostic implications. Moreover, high glycolytic flux was detected in T-ALL...
|
|
|
Analýza vlivu mutací v genu pro nukleofosmin na jeho interakční potenciál
Šašinková, Markéta ; Brodská, Barbora (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent) ; Starková, Júlia (oponent)
Nukleofosmin 1 (NPM1; nucleophosmin 1) se v buňce vyskytuje převážně v jadérku, ve formě oligomerů tvořených skrze N-koncovou doménu (NTD; N-terminal domain), a jako molekulární chaperon a transportní protein má široké spektrum interakčních partnerů včetně p53 či p14Arf. Mutace v C-koncové oblasti NPM1 je prokazována asi u 30 % pacientů s akutní myeloidní leukémií (AML; acute myeloid leukemia) a projevuje se aberantní expresí mutovaného (mut; mutated) NPM1 v cytoplazmě. V důsledku toho dochází v leukemických buňkách s mutNPM1 k přesunu mnoha proteinů s ním interagujících, včetně jeho přirozené formy (wt; wild-type), do cytoplazmy. Pro detekci interakcí a oligomerních komplexů NPM1 jsme zavedli a optimalizovali jak in vitro techniky - nativní a seminativní gelovou elektroforézu a imunoprecipitaci, tak testování in vivo - konfokální mikroskopii a metody časově rozlišené fluorescence. Těmito metodami jsme prokázali, že v důsledku C-terminální mutace NPM1 dochází k narušení jeho interakce s jadérkovým proteinem nukleolinem (NCL; nucleolin), která se tvoří mimo NTD, a že komplex mutNPM1-NCL nevzniká ani po ošetření buněk cytotoxickými léčivy navozujícími relokalizaci obou partnerů do stejného buněčného kompartmentu. V naší studii dále ukazujeme, že oligomery mutNPM1 jsou méně stabilní než oligomery...
|
|
|
Metabolic alterations in cancer cells and their implications in the therapy of acute leukemias
Harárová, Alžbeta ; Starková, Júlia (vedoucí práce) ; Mrvová, Silvia (oponent)
Metabolizmus nádorových buniek sa odlišuje od metabolizmu zdravých buniek vo viacerých ohľadoch. Prvou popísanou odlišnosťou metabolizmu nádorových buniek bola aeróbna glykolýza, pri ktorej bunky konvertujú pyruvát na laktát aj za normoxických podmienok. Odlišnosti boli ďalej popísané v citrátovom cykle, v metabolizme aminokyselín (predovšetkým glutamínu, asparagínu a serínu) a tiež v metabolizme lipidov. Spoločným znakom týchto zmien je prevládnutie anabolických dráh, umožňujúce rýchlu proliferáciu nádorových buniek. Zvláštny význam má štúdium metabolizmu nádorových buniek rezistentných na liečbu, ktorých odlišný metabolický profil je nielen potenciálnym markerom, ale tiež terapeutickým cieľom. Väčšina metabolických odlišností bola po prvýkrát popísaná v solídnych nádoroch, zatiaľ čo metabolizmu akútnych leukémií začala byť venovaná väčšia pozornosť až v posledných rokoch. Asparagináza je príkladom chemoterapie využívajúcej metabolickú odlišnosť leukemických buniek. Špecifický metabolizmus je tiež spájaný s rezistenciou buniek akútnej leukémie voči glukokortikoidom. Podrobné štúdium špecifického metabolizmu leukemických buniek objasnilo mechanizmus vzniku rezistencie voči asparagináze a tiež voči glukokortikoidom a naznačilo možné využitie týchto zmien v cielenej terapii. Kľúčové slová: metabolizmus,...
|
|
|
Role genu HOXA9 v leukemogenezi
Rejlová, Kateřina ; Starková, Júlia (vedoucí práce) ; Fraiberk, Martin (oponent)
Evolučně konzervovaná rodina homeoboxových genů hraje důležitou roli ve vývoji anterior-posteriorní osy těla obratlovců. Významným způsobem také ovlivňuje vývoj krevních buněk neboli hematopoézu. Rozsáhlé výzkumy homeoboxových genů v oblasti hematopoézy přispěly k prokázání vlivu těchto genů rovněž v leukemogenezi. Vzhledem k tomu, že leukémie neboli maligní onemocnění krevních buněk je jednou z nejčastějších malignit v dětském věku, výzkum tohoto onemocnění se stal stěžejním pro řadu vědců. Do dnešní doby se však neprokázalo, které stádium maligní transformace homeoboxové geny ovlivňují. Dále se rovněž zkoumá, zdali je jejich význam v patogenezi klíčový, nebo mají-li pouze vedlejší efekt. Nejvíce prozkoumaný homeoboxový gen v leukemogenezi je gen HOXA9, u něhož byla prokázána korelace s prognózami pacientů u některých leukémií. V mnoha studiích byl popsán vliv HOXA9 na leukemickou transformaci buněk, z čehož lze usuzovat, že by tento gen mohl být slibným cílem budoucí leukemické terapie. Tato práce je zaměřena především na gen HOXA9 a jeho spojení s leukemickou transformací krevních buněk.
|
|
|
Mechanismus účinku L-asparaginázy u dětské akutní lymfoblastické leukemie
Heřmanová, Ivana ; Starková, Júlia (vedoucí práce) ; Šálek, Cyril (oponent) ; Trbušek, Martin (oponent)
Akutní lymfoblastická leukémie (ALL) je nejčastější nádorové onemocnění u dětí. L-asparagináza (ASNáza) klíčová složka terapie dětské ALL, hydrolyzuje plazmatický asparagin a glutamin. Leukemické buňky jsou na depleci aminokyselin citlivé, protože mají v porovnání se zdravými buňkami sníženou aktivitu asparagin syntetázy (ASNS). Léčba dětské ALL je velmi úspěšná, přesto se v některých případech projevují nežádoucí účinky a rezistence na terapii. Příčiny nebyly dosud spolehlivě vysvětleny. V naší práci jsme chtěli objasnit, do jaké míry exprese genu pro ASNS ovlivňuje citlivost ALL buněk k ASNáze. Dále jsme se zaměřili na detailní mechanismus účinku ASNázy, s cílem vysvětlit příčiny rozdílné citlivosti leukemických pacientů k tomuto léčivu. Pro studium vztahu mezi expresí genu pro ASNS a citlivostí k ASNáze jsme použili BCP ALL buněčné linie (REH, NALM-6, RS4;11 a UOCB-6) a 30 diagnostických BCP ALL vzorků. Pomocí RNA interference jsme u ALL linií gradientově snížili expresi genu pro ASNS. Definovali jsme hraniční hodnotu exprese genu pro ASNS, pod jejíž úrovní již exprese genu pro ASNS nekoreluje s citlivostí k ASNáze. Hladina exprese genu pro ASNS u pacientských vzorků je pod definovanou hranicí. Dále jsme potvrdili, že citlivost ALL diagnostických vzorků k ASNáze nekoreluje s expresí genu pro...
|
|
|
Nové přístupy léčby u pacientů s TEL/AML1 pozitivní akutní lymfoblastickou leukémií
Starková, Júlia ; Trka, Jan (vedoucí práce) ; Sedláček, Zdeněk (oponent) ; Štěrba, Jaroslav (oponent) ; Schwarz, Jiří (oponent)
Leukémie je charakterizována akumulací nezralých, abnormálních krevních buněk v krvi a kostní dřeni, které kompetují s normálními hematopoetickými buňkami. Tento stav vede k selhání normální hematopoézy, projevujícímu se anemií, infekcemi a krvácením, leukemické buňky navíc mohou invadovat do ostatních tkání a orgánů. Potlačení normální krvetvorby souvisí s klinickými symptomy onemocnění. Na základě klinických projevů se leukémie dělí na akutní (AL) a chronické a na základě typů buněk, ze kterých pocházejí, do dvou hlavních skupin na Iymfoidní a myeloidní. U dětí tvoří leukémie asi 1/3 všech nádorových onemocně n í. Z toho 80% tvoří akutní lymfoblastická leukémie (ALL), incidence je 3 nové případy /100 000 dětí a adolescentů do 15 věku života za jeden rok. V České republice onemocní ročně asi 65-70 dětí. Dalších 15-20% tvoří akutní myeloidní leukémie a zbylé případy jsou chronické myeloidní leukémie a ostatní typy příbuzné leukémie. Nejčastěji je toto onemocnění diagnostikováno mezi 2. a 6. rokem života. Molekulární analýzy běžných genetických abnormalit v leukemických buňkách přispěly k porozumění patogeneze a ke zlepšení prognózy ALL u dět í (1 ,2 ). Chromosomální přestavby u tohoto onemoc nění často přítomné způsobují aberantní expresi protoonkogenů a tvoří fúzní geny, které kódují konstitutivně aktivní...
|
|
|
Role fúzního proteinu ETV6-RUNX1 v citlivosti leukemických buněk na L-asparaginázu
Staněk, Petr ; Starková, Júlia (vedoucí práce) ; Burjanivová, Tatiana (oponent)
Translokace t(12;21) s přítomností fúzního genu ETV6-RUNX1 (TEL-AML1) je nejčastější chromozomová aberace nacházená u akutní lymfoidní leukemie v dětském věku. Výskyt ETV6- RUNX1 se pojí s výborným výhledem a vysokou citlivostí na léčbu enzymem L-asparaginázou (ASNázou), která deaminuje aminokyseliny glutamin a asparagin. Rezistence na toto léčivo zhoršuje prognózu a zvyšuje riziko selhání léčby, proto se pracovní skupina CLIP věnuje určení mechanismu účinku ASNázy a příčin vzniku rezistence. Tato práce na dřívější poznatky skupiny navazuje a věnuje se analýze významu fúzního proteinu a signalizačním a metabolickým změnám doprovázející posuny v citlivosti leukemických buněk na L-asparaginázu. V první části práce se vytvořením posunu čtecího rámce ve fúzním genu pomocí systému CRISPR/Cas9 podařilo vytvořit knockoutní buněčné klony se stabilně zvýšenou rezistencí vůči ASNáze. Úspěšnou mutageneze a odstranění fúzního proteinu byla ověřena na úrovni DNA, mRNA a proteinu a analýzou SNP byla vyloučena přítomnost jiných závažných aberací ovlivňujících citlivost k chemoterapeutiku. Ve druhé části práce jsem se zabýval pozorování signalizační reakce vyvolané přítomností ASNázy, zejména v souvislosti se signalizačním komplexem mTORC1, a dále odlišných aspektů této reakce mezi původními liniemi REH a klony...
|
|
|
Změny v metabolismu aminokyselin u nádorových buněk a jejich využití v cílené terapii
Šafrhansová, Lucie ; Starková, Júlia (vedoucí práce) ; Zelenka, Jaroslav (oponent)
Účinky cílené terapie v léčbě nádorových onemocnění jsou intenzivně zkoumány a testovány v mnoha klinických studiích. Na rozdíl od klasické chemoterapeutické léčby by cílená terapie měla na nádorové buňky působit specificky, s omezenou toxicitou a nižším rizikem vedlejších účinků. Jeden z typů cílené terapie využívá Achillovu patu rakoviny - specifika nádorového metabolismu. Se znalostmi metabolických odlišností nádorových a normálních buněk lze nastavit podmínky, které normální buňky snadno překlenou, zatímco nádorové buňky v jejich důsledku odumírají. Toho lze dosáhnout odstraněním některých aminokyselin z extracelulárního prostředí, na kterém jsou nádorové buňky závislé. Proslulým a po mnoho let terapeuticky využívaným enzymem je asparagináza. Asparaginázová terapie je ale úspěšná jen u některých druhů rakoviny, proto je zapotřebí další vývoj a také hledání enzymů s obdobnými účinky. V průběhu let byly objeveny další čtyři enzymy, které by se v budoucnu mohly stát nedílnou součástí léčby onkologických pacientů - arginindeimináza, argináza, methionináza a cyst(e)ináza. Minulé a současné studie zkoumají jejich účinky na nádorové buňky in vitro a in vivo. Úspěšná likvidace nádorových buněk s sebou často přináší limity v podobě imunogenicity a rezistence. S každou další studií tak přicházejí...
|
host ::
RSS.