|
|
Photon-upconversion nanoparticles for single-molecule immunosensing of cancer biomarkers and bacteria
Farka, Z. ; Mickert, M. J. ; Hlaváček, Antonín ; Poláchová, V. ; Kostiv, Uliana ; Pastucha, M. ; Horák, Daniel ; Gorris, H. H. ; Skládal, P.
The recent progress in the field of immunoassays has been driven by introduction of various kinds of nanomaterials. In particular, photon-upconversion nanoparticles (UCNPs) proved to be excellent immunoassay labels due to their ability to emit light of shorter wavelengths under near-infrared excitation (anti-Stokes emission), which prevents autofluorescence, minimizes light scattering, and thus reduces the optical background interference. These unique photoluminescent properties allow counting of individual biomolecules labeled with UCNPs by conventional wide-field epiluminescence microscopy and enable the development of single-molecule (digital) immunoassays. We have introduced a novel label based on UCNPs conjugated with streptavidin via poly(ethylene glycol) and applied it in a digital upconversion-linked immunosorbent assay (ULISA) for the detection of a cancer biomarker prostate specific antigen (PSA). The digital readout based on counting of individual immunocomplexes improved the sensitivity 16× compared to conventional analog readout and allowed to reach a limit of detection (LOD) of 23 fg·mL−1 (800 aM). Human serum samples were successfully analyzed achieving an excellent correlation with electrochemiluminescence reference method. The conjugates of UCNPs with streptavidin are also suitable for the detection of pathogenic bacterium Melissococcus plutonius, the causative agent of honeybee disease European foulbrood. The ULISA assay provided an LOD of 340 CFU·mL−1 and successfully analyzed real samples of bees, larvae and bottom hive debris. Due to the high reliability and relatively simple detection scheme, the digital ULISA can pave the way for a new generation of digital immunoassays with a strong potential for commercialization.
|
|
|
NÁVRH OPTOVLÁKNOVÉHO BIOSENZORU SE SPEKTRÁLNÍ ANALÝZOU V BLÍZKÉ INFRAČERVENÉ OBLASTI
Křepelka, Pavel ; Jakubec,, Martin (oponent) ; Skládal, Petr (oponent) ; Mikulka, Jan (vedoucí práce)
Práce se zabývá měřením a interpretací NIR spekter bakteriálních buněk a výzkumem biosenzorických technik, využívající tuto analytickou techniku. Je zde rozebrán současný stav vědění v oblasti NIR spektroskopie v mikrobiologii a technologie optovláknových biosenzorů. Z rozboru vyplývá, že NIR je vhodnou technikou pro přímou molekulární analýzu bakterií, která však trpí nízkou citlivostí a nedostatečnou interpretací bakteriálních spekter. V další části práce je uveden teoretický rozbor technik spektrální analýzy a technologie optovláknových senzorů. V praktické části práce jsou představeny experimenty a výzkum vedoucí k odstranění těchto nevýhod NIR spektroskopie v mikrobiologii. Je zde shrnuta řada experimentů sloužící k interpretaci NIR spekter bakterií a návrh optovláknového senzoru pro zvýšení citlivosti této techniky. V této práci byly určeny a částečně interpretovány spektrální regiony důležité pro identifikaci bakteriálních kmenů a navržen senzor pro analýzu bakterií, který je schopný klasifikovat kmeny na základě 105 zachycených buněk. Tím byly splněny cíle této práce.
|
|
|
Electronic effects at the interface between biomolecules, cells and diamond
Krátká, Marie ; Rezek, Bohuslav (vedoucí práce) ; Cifra, Michal (oponent) ; Skládal, Petr (oponent)
Pro biomedicínské aplikace, jako jsou biosenzory, bioelektronika, tkáňové inženýrství, optimalizace materiálů pro implantáty, monitorování životního prostředí atd., je zásadní interakce mezi biologickým prostředím (buňky, proteiny, tkáně, membrány, elektrolyty apod.) a povrchem pevné látky. Diamant může v tomto směru poskytnout unikátní kombinaci výborných polovodičových, mechanických, chemických, biokompatibilních a dalších vlastností. V této dizertační práci charakterizujeme elektronické vlastnosti rozhraní protein- diamant pomocí polních tranzistorů na bázi diamantu zakončeného vodíkem, jehož hradlo je vystaveno biologickému médiu (SGFET). Objasňujeme roli adsorbované proteinové vrstvy na elektronickou odezvu diamantového tranzistoru. Zkoumáme vliv buněk (převážně osteoblastů jako modelových buněk) na převodní charakteristiky a na svodové proudy diamantových polních tranzistorů. Pro posouzení vlivu hranic zrn a sp2 fáze na bio-elektronickou funkci diamantových SGFETů jsme použili vrstvy nanokrystalického diamantu o různých velikostech zrn (80 nm - 250 nm). Studujeme vliv gamma záření na funkci a stabilitu diamantových polních tranzistorů s proteiny a buňkami, což může být užitečné pro monitorování biochemických procesů během radiační léčby. Vyvinuli a otestovali jsme přenosné zařízení pro měření...
|
|
|
Photon-upconverting nanoparticles as a novel background-free label in immunoassays
Farka, Z. ; Hlaváček, Antonín ; Mickert, M. J. ; Skládal, P. ; Gorris, H. H.
Photon-upconverting nanoparticles (UCNPs) have become an attractive label in immunoassays because their anti-Stokes luminescence can be excited by the NIR laser and detected in the VIS region without optical background interference. Further advantages of UCNPs include good photostability, large anti-Stokes shifts, and multiple narrow emission bands that can be used for multiplexed detection. We have developed a competitive upconversion-linked immunosorbent assay (ULISA) for detection of the pharmaceutical diclofenac (DCF) in surface waters. Silica-coated UCNPs (50 nm in diameter) with carboxyl groups on the surface were synthesized and conjugated with the secondary anti-IgG antibody. The structure and monodispersity of the nanoconjugates was studied by TEM and agarose gel electrophoresis. Using a highly affine anti-DCF primary antibody, the optimized ULISA provided a detection limit of 50 pg·mL−1.
|
|
|
Study of Biomolecular Interactions with Surface Plasmon Resonance Biosensors
Šípová, Hana ; Homola, Jiří (vedoucí práce) ; Houska, Milan (oponent) ; Skládal, Petr (oponent)
Biosenzory s povrchovými plasmony (SPR biosenzory) jsou moderní technologií, která umožňuje sledování biomolekulárních interakcí v reálném čase. Tato doktorská práce popisuje jejich vývoj a aplikaci pro studium a detekci vybraných biomolekulární interakcí. Mezi optimalizované parametry patří způsob imobilizaci biomolekul na povrch SPR čipu a parametry mikrofluidického systému, který zajišťuje dopravu vzorku do reakční komůrky. Je diskutováno několik způsobů, jak transport biomolekul k povrchu senzoru zrychlit a tak zvíšit citlivost senzoru pro detekované látky. Dále je popsáno několik detekčních schémat, které umožňují detekci nízkých koncentrací nukleových kyselin v reálných vzorcích, resp. detekci bodových mutací v sekvenci nukleové kyseliny. Byly vyvinuty nové metody pro studium enzymatické aktivity HIV integrázy a ribonukleázy H, které mohou sloužit k vývoji antivirálních léčiv, resp. léčiv pro genovou terapii.
|
|
|
Použití kovových a polovodičových nanostruktur pro biodetekci
Kejík, Lukáš ; Skládal, Petr (oponent) ; Kolíbal, Miroslav (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá dvěma způsoby aplikace zlatých diskových nanostruktur vykazujících plazmonové rezonance pro biodetekci. První část se týká detekce změny fáze na plazmonických anténách pomocí koherencí řízeného holografického mikroskopu. Bylo zjištěno, že změna fáze se zvýrazňuje s rostoucí vlnovou délkou osvitu, kdy je buzena plazmonová rezonance na anténách větších rozměrů. Dále byla prokázána citlivost fáze na změnu indexu lomu okolního prostředí, přičemž největší fázová změna nastala pro antény v rezonanci s vlnovou délkou osvitu. Druhá část práce se týká kombinace optické spektroskopie detekující plazmonové rezonance a voltametrie charakterizující elektrochemickou aktivitu. V této části byl pozorován postupný posuv rezonanční vlnové délky v přítomnosti SSC pufru, avšak tento vliv je s časem stále menší. Provedené experimenty také ukázaly nevhodnost užití kyslíkového plazmatu k čištění povrchu vzorku, protože způsobuje oxidaci kovů včetně zlata.
|
|
|
Nanostructured gold electrodes for determination of glucose in blood
Farka, Z. ; Juřík, T. ; Kovář, D. ; Podešva, Pavel ; Foret, František ; Skladal, P.
Fast and sensitive devices for monitoring of glucose are crucial in today’s medicine. Most of the commercial glucometers are currently based on enzymatic catalysis which provides reasonable sensitivity but has a drawback in limited enzyme stability. With the development of novel surfaces, new generation of non-enzymatic sensors characterized by high sensitivity and stability is emerging. In this work, gelatin-templated nanostructured gold electrodes were developed and applied for non-enzymatic glucose determination. The analysis was done by direct electrochemical oxidation during cyclic voltammetry and amperometry with the limit of detection at 1.3 μM. The ability to detect physiological levels glucose in presence of interferents was demonstrated on deproteinized human blood serum.
|
|
|
The Synthesis, Surface Modification and Stability of SPIO Nanoparticles for MRI Application
Kovář, D. ; Fohlerová, Z. ; Malá, A. ; Jiřík, Radovan ; Starčuk jr., Zenon ; Kalina, M. ; Skládal, P.
The biocompatibility and biodegradability of new magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents is high-ly desired. The superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles are suitable candidates for these pur-poses. Here the co-precipitation technique for synthesis of monodispersed SPIO nanoparticles is pre-sented. The critical point of the synthesis is core formation and consequent crystal growth. The conditions for core formation (time, temperature, rate of base addition) were optimised. The nanoparticles were stabilised by either silanisation or polymer coating (cationic chitosan, poly-D-Arg, dextran, gelatine, hyaluronic acid). The stability was investigated in physiological pH, different ionic strength solutions, PBS-albumine solution or blood plasma. The biocompatibility was tested in vitro either in the presence of Saccharomyces cerevisiae or erythrocytes suspension. The size and shape was investigated by atomic force microscopy (AFM) and scanning electron microscopy (SEM). The molecular structures of nanoparticles were investigated by FTIR (Fourier transform infrared spectroscopy). The iron cations were determined using the Prussian blue staining test. The stability of nano-particles was investigated by the zeta potential using the method of electrophoretic light scattering (ELS).
|
host ::
RSS.