|
|
Localization matters: function of paxillin and phopholipids in the cell nucleus
Marášek, Pavel ; Hozák, Pavel (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Žárský, Viktor (oponent)
(Czech) Paxillin i PIP2 jsou dobře známé součásti každé buňky, i když odlišné povahy. Paxillin, protein fokálních adhezí, šíří signál z extracelulární matrix prostřednictvím integrinů a receptory růstových faktorů, a tak reguluje buněčnou motilitu a migraci buněk (Schaller, 2001). PIP2, hlavní stavební kámen buněčných membrán, který je fosfolipasou C štěpen na tzv. druhé posly (Hokin and Hokin 1953; Streb et al. 1983). V nedávné době bylo prokázáno, že obě molekuly jsou také lokalizovány v jádře. Jejich dosud známé funkce jsou detailně prozkoumány, ale my nyní odhalujeme zcela odlišné funkce těchto biologických složek, a to navíc v úplně odlišných částech buňky, než kde se jejich lokalizace předpokládá. V této práci ukazujeme, že paxillin je důležitým faktorem buněčného jádra, kde kontroluje expresi dvou důležitých genů IGF2 a H19, které řídí růst buňky. Paxillin nemění alelickou expresi těchto imprintovaných genů, ale reguluje chromosomální interakce mezi promotory IGF2/H19 a jejich společným enhancerem na aktivní alele. Přesněji řečeno, paxillin stimuluje interakci mezi enahncerem a promotorem genu IGF2, čímž zesiluje transkripci IGF2, zároveň paxillin brání interakci mezi enhancerem a promotorem H19, a tím snižuje transkripci H19. Nalezli jsme paxillin v komplexu s kohesiny a také Mediatorem RNA...
|
|
| |
|
|
GAL4/UAS binární systém jako nástroj pro studium genové funkce
Soukup, Tomáš ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent)
GAL4/UAS systém je bipartitním nástrojem genového inženýrství, umožňujícím ektopickou expresi in vivo v časovém i tkáňově specifickém kontextu. Design této techniky vychází z mechanismů regulace genové transkripce, objasněných z veliké části experimentálním studiem regulace metabolického okruhu pro zpracování galaktosy organismu Saccharomyces cerevisiae. Nezávislou inkorporací genu pro transkripční faktor Gal4p a jeho vazebné sekvence (UAS) za pomoci transposibilních technik a technik pro integraci do specifické části genomu je možné generovat stovky stabilních, transgenních linií. Křížením jedince z GAL4 linie s jedincem z UAS linie lze následně získat jedince, vykazujícího za vhodných, regulovatelných podmínek ektopickou expresi. Tato práce představuje syntézu základních principů GAL4/UAS systému a jeho variant, adaptovaných zejména pro potřeby genových manipulací s modelovými organismy Drosophila melanogaster a Danio rerio. Dále tento text shrnuje propojení GAL4/UAS systému s dalšími technikami a ve stručnosti poukazuje na možnosti praktické aplikace zejména na poli neurologie. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Funkce proteinu Slu7 v sestřihu pre-mRNA Saccharomyces cerevisiae
Ničová, Eva ; Půta, František (vedoucí práce) ; Vašicová, Pavla (oponent)
Alternativní sestřih je jedním z nástrojů regulace genové exprese. Za různých podmínek mohou z jednoho buněčného transkriptu vznikat různé mRNA kódující proteiny s různou funkcí, lokalizací či stabilitou. Lidský protein hSlu7 ovlivňuje alternativní sestřih některých genů prostřednictvím volby alternativních 3'sestřihových míst (3'SS). Ačkoli se původně zdálo, že kvasinky Saccharomyces cerevisiae alternativní sestřih nevyužívají, v poslední době se množí důkazy, že tomu tak není. Rozhodli jsme se proto blíže charakterizovat funkci kvasinkového Slu7, který se účastní druhého kroku sestřihu pre-mRNA a je úzce spjatý s volbou 3'SS. Pozornost jsme zaměřili na vysoce sekvenčně konzervovaný, doposud nepopsaný motiv v esenciální části proteinu, nazvaný motiv RED. Mutace v motivu způsobují defekt druhého kroku sestřihu některých substrátů a ovlivňují poměr využití alternativních 3'SS některých sestřihových konstruktů. Výsledky pokusů ukazují na roli motivu ve výběru především distálních 3'SS. Genetické interakce mutací slu7 s alelami genů PRP45 a PRP22 rozšiřují spletitou interakční síť sestřihových faktorů a naznačují možnou roli Slu7p ve vazbě Prp22p na spliceosom.
|
|
|
Homeostáze kationtů alkalických kovů patogenních kvasinek rodu Candida
Elicharová, Hana ; Sychrová, Hana (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent) ; Půta, František (oponent)
Kvasinky rodu Candida jsou oportunní patogeny schopné vyvolat závažné systémové infekce u imunokompromitovaných pacientů. Virulence jednotlivých druhů kan- did závisí mimo jiné na jejich odolnosti vůči proměnlivosti vnějšího prostředí. Udržování homeostáze kationtů alkalických kovů, čili na jedné straně schopnost akumulovat dostatečné množství draselných iontů a na straně druhé úspěšně čelit jejich vysoké extracelulární koncentraci, je nezbytné pro růst a virulenci kandid. V rámci této práce jsme popsali souvislost mezi tolerancí k solím a rezistencí k flukonazolu u šesti druhů kandid a možný mechanismus této interakce. Flu- konazol hyperpolarizuje plasmatickou membránu buněk kandid a zvyšuje tak nespecifický vstup kationtů alkalických kovů do buňky, čímž výrazně narůstá citli- vost kandid k solím těchto kationtů. Popsaný mechanismus má obecnou platnost, nebot' flukonazol zvyšuje senzitivitu kandid i k dalším kladně nabitým látkám, které vstupují do buňky v závislosti na velikosti membránového potenciálu. Účinek flukonazolu na membránový potenciál a tedy i na vstup kationtů alkalických kovů do buňky obrátil naši pozornost k homeostázi draselných kationtů, jejichž relativně vysoká...
|
|
| |
|
|
Prp45 v regulaci exprese paralogních genů TUB1 a TUB3 v S. cerevisiae
Cihlářová, Zuzana ; Půta, František (vedoucí práce) ; Schierová, Michaela (oponent)
Prp45 je esenciální sestřihový faktor kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Lidský ortholog Prp45 - protein SNW1/SKIP - je zapojen do regulace sestřihu pre-mRNA a pravděpodobně ovlivňuje proces transkripce a modifikace histonů. Naše laboratoř odhalila genetické interakce sestřihového faktoru Prp45 nejen s proteiny zahrnutými v sestřihu pre-mRNA, ale rovněž také s faktory důležitými pro elongaci transkripce a s efektory chromatinových modifikací. Naše předběžné výsledky tak naznačují, že by protein Prp45 mohl sloužit jako faktor propojující sestřih, transkripci a stav chromatinu u S. cerevisiae. Prvním cílem této diplomové práce bylo prozkoumat roli intronů v regulaci genové exprese paralogních genů TUB1 a TUB3, a zda je tato regulace závislá na sestřihu. Pomocí kvantitativní PCR jsem zjistila, že exprese paralogních genů TUB1 a TUB3 není závislá na přítomnosti jejich intronů a ani na funkčním sestřihu. Druhým cílem této diplomové práce bylo zjistit potenciální úlohu proteinu Prp45 v regulaci chromatinového stavu. Pro tento účel jsem zavedla systém β-estradiolem indukované exprese značeného histonu H3 a následně jsem metodou chromatinové imunoprecipitace měřila inkorporaci tohoto histonu do nukleozomů. I přes nedostatečnou průkaznost výsledky naznačují, že by mutace prp45(1-169) mohla zvyšovat dynamiku...
|
|
|
Cysteine tRNA regulates protein synthesis in human cell lines
Kučerová, Michaela ; Beznosková, Petra (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent)
Velká část lidských genetických chorob je asociovaná s nonsense mutacemi vedoucími ke vzniku předčasného terminačního kodonu v kódující sekvenci. Terminační kodon může být pročten pomocí near-cognate tRNA (tRNA se dvěma bazemi antikodonu párujícími se stop kodonem), což nazýváme tzv. readthrough; toto může vést k tvorbě C-terminálně extendovaných variant proteinu. Schopnost indukovat readthrough UGA stop kodonu byla v kvasinkách popsána u tRNA-Trp a tRNA-Cys. V lidské buněčné linii HEK293T byla popsána u lidské tRNA-Trp. Cílem této práce bylo zjistit, zda také lidská tRNA-Cys může fungovat jako near-cognate tRNA v lidské buněčné linii HEK293T. Rodina tRNA-Cys je tvořena dvěma isoakceptory, jeden nese antikodon ACA, druhý GCA. Existuje 1 isodecoder ACA a 23 isodecoderů GCA isoakceptoru. V této práci bylo testováno celkem 9 isodecoderů lidské tRNA-Cys (lišících se sekvencí a mírou exprese) pro schopnost pročíst stop kodon UGA v HEK293T za použití p2luci a pSGDluc dual-luciferase vektorů. Pozorovali jsme, že v p2luci i pSGDluc je minimálně jeden isodecoder, tRNA-Cys-GCA-4-1, schopen zvýšit readthrough stop kodonu UGA při zvýšení exprese tohoto isodecoderu v HEK293T. Tyto výsledky naznačují, že stejně jako v kvasinkách, je i v lidských buněčných liniích tRNA-Cys schopna inkorporovat se na stop kodon...
|
|
|
Vodorozpustné polymerní nanomateriály v protinádorové terapii
Vinklerová, Laura ; Etrych, Tomáš (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent)
Protinádorová léčba zahrnuje několik terapeutických postupů. Jedním z nich je chemoterapie využívající nízkomolekulární cytostatická léčiva, jejichž nevýhodou je celosystémový projev cytostatických účinků i ve zdravé tkáni. V důsledku toho se na konci minulého století přišlo s novým konceptem vysokomolekulárních polymerních nanomateriálů, které minimalizují vedlejší účinky léčby. Vazba léčiva na polymerní nanomateriál umožňuje zlepšit biodistribuci léčiva v těle a tím snížit jeho toxicitu, a zároveň často vede k významnému navýšení protinádorové aktivity. Struktura zmíněných vysokomolekulárních polymerních nanomateriálů a jejich konjugátů s léčivy využívá rozdílů mezi zdravou a nádorovou tkání. Jednou z významných odlišností je produkce enzymů matrix metaloproteináz v nádorovém mikroprostředí, která se zejména využívá k uvolňování léčiva vázaného na polymerní nosič v nádorové tkáni. Klíčová slova: polymerní nanomateriál, matrix metaloproteináza, uvolnění léčiva, penetrace, efekt EPR
|
|
|
Noncanonical human eIF4Es in and out of the RNA granules
Frydrýšková, Klára ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Eukaryontní translační iniciační faktor eIF4E1 řídí iniciaci translace závislou na čepičce, vyskytuje se v P-tělíscích a je důležitý pro vznik stresových granulí (SG). V lidských buňkách jsou obsaženy také dva další nekanonické translační iniciační faktory, eIF4E2 a eIF4E3. Oba váží čepičku, ačkoliv slaběji než eIF4E1. V rámci této práce jsem se zabývala schopností jednotlivých členů z rodiny proteinů eIF4E a jejich variant lokalizovat do stresových granulí a P-tělísek za klidových podmínek a za podmínek tepelného a arsenitanového stresu. Za všech testovaných podmínek lokalizovaly proteiny eIF4E1 a eIF4E2 a všechny jejich testované varianty do P-tělísek na rozdíl od variant proteinu eIF4E3. Za obou stresových podmínek všechny varianty proteinu eIF4E1 a varianta eIF4E3-A lokalizovaly do SG, avšak schopnost jednotlivých proteinů lokalizovat do SG se lišila. Protein eIF4E2 lokalizoval ve zvýšené míře pouze do SG vyvolaných tepelným stresem. Při detailnějším studiu jsme ukázali, že za tepelného stresu vznikají dva typy SG ve vztahu k eIF4E proteinům. Přibližně 75 % SG indukovaných tepelným stresem obsahuje všechny tři eIF4E proteiny, zatímco ve 25 % z nich protein eIF4E2 chybí. Dále jsme ukázali, že protein velké ribosomální podjednotky L22 je specificky nabohacen v SG vyvolaných arsenitanovým stresem....
|
host ::
RSS.