|
|
Analýza promotorů genů kódujících faktory sigma u patogenních korynebakterií s využitím modelu Corynebacterium glutamicum
Kučera, Tomáš ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Mikušová, Gabriela (oponent)
Cílem této diplomové práce bylo identifikovat potenciální promotory genů kódujících faktory sigma u patogenních korynebakterií s využitím modelové bakterie Corynebacterium glutamicum a posoudit vliv sekvence aminokyselin proteinů sigma na rozpoznání promotoru. Faktory sigma jsou nezbytné pro transkripci a regulaci genové exprese a hrají klíčovou roli při řízení aktivity promotorů. Pochopení regulace genů kódujících faktory sigma je zásadní, protože přispívají k virulenci a patogenitě a regulují obrannou reakci proti imunitnímu systému hostitele. V této práci se analyzovaly promotorové oblasti genů kódujících faktory sigma u bakterií Corynebacterium ulcerans a Corynebacterium diphtheriae. Nejprve byly identifikovány potenciální sekvence promotorů v genomech C. ulcerans a C. diphtheriae na základě znalosti konvenčních sekvencí potvrzených promotorů v modelovém organismu. Vyhodnocení aktivity navržených promotorových oblastí sloužil odzkoušený dvouplazmidový systém vytvořený v C. glutamicum. Do vektoru pEPR1 byla vložena potenciální promotorová oblast před reportérový gen gfpuv a do vektoru pEC-XT99A byly před inducibilní promotor vloženy geny faktorů sigma. S využitím fluorescence se měřila aktivita reportérového genu v reakci na indukovaný faktor sigma z C. glutamicum, C. ulcerans nebo C....
|
|
|
Mechanizmus antibakteriálního účinku 4. generace lipofosfonoxinů
Helusová, Michaela ; Mikušová, Gabriela (vedoucí práce) ; Mašín, Jiří (oponent)
Lipofosfonoxiny jsou malé syntetické antimikrobiální molekuly, jejíchž zásahovým místem je cytoplazmatická membrána bakterií. Tato práce se zaměřuje na porovnání a podstatu rozdílu v aktivitě tří vybraných zástupců lipofosfonoxinů 4. generace, které se liší počtem uhlíků v jednotlivých modulech a také svou antibakteriální a hemolytickou aktivitou. Nejslibnějším kandidátem je látka 7072 vykazující dobrou antimikrobiální aktivitu a nízkou hemolytickou aktivitu. Dalšími testovanými lipofosfonoxiny jsou hemolytický 7070 a antibakteriálně slabě účinný 7107. V této práci je zkoumána jejich pórotvorná aktivita na modelových membránách i na živých buňkách Staphylococcus aureus a Escherichia coli. Výsledky naznačují, že i malý rozdíl ve struktuře může mít zásadní vliv na aktivitu těchto molekul. Lipofosfonoxiny 7072 a 7070 vykazují stejnou aktivitu proti bakteriím, kdy jejich baktericidní účinek spočívá ve vytváření pórů v cytoplazmatické membráně. Bakterie účinkem lipofosfonoxinů rychle hynou následkem ztráty membránového potenciálu. Vysoká hemolytická aktivita látky 7070 pravděpodobně souvisí s její preferencí k nenabitým membránám. Podstata slabé antimikrobiální aktivity látky 7107 je dána tvorbou pouze malých pórů a také neschopností překonat a rozrušit vnější membránu. Klíčová slova: antimikrobiální...
|
|
|
Interakce chřipkového viru s buněčnými obrannými mechanismy
Vochyánová, Klára ; Drda Morávková, Alena (vedoucí práce) ; Mikušová, Gabriela (oponent)
Infekce chřipkovým virem patří mezi nejaktuálnější problémy dnešní doby. Unikátní schopnost tohoto viru silně inhibovat imunitní odpověď buněk na mnoha úrovních a jeho pandemický potenciál z něj činí předmět zájmu mnoha vědeckých skupin. Chřipkový virus používá k inhibici imunitní odpovědi především protein NS1. Protein NS1 je jednak schopen vázat se na RNA, a maskovat jí před rozpoznáním buněčnými senzory a dalšími proteiny. Protein NS1 obsahuje také katalytickou doménu. Pomocí této domény interaguje s mnoha buněčnými proteiny, zasahuje do signální transdukce a zajišťuje tak úspěch celé infekce. Protein NS1 je jedním z hlavních nástrojů patogenicity chřipkového viru a zaslouží si patřičnou pozornost.
|
|
|
Produkce toxinů bakterií Bacillus subtilis a jejich role v konkurenčním boji s dalšími bakteriemi
Šureková, Kristína ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Mikušová, Gabriela (oponent)
Bacillus subtilis je gram pozitivní půdní bakterie, která je v prostředí obklopena mnoha jinými mikroorganismy. Z tohoto důvodu je potřebné, aby byla bakterie schopná soutěžit s těmito mikroorganismy o živiny a životní prostor. B. subtilis má ve své genetické výbavě moduly, které ji pomáhají v konkurenceschopnosti. Tyto moduly jsou označeny jako toxin- antitoxin systémy. Tato diplomová práce je zaměřena na identifikaci dosud nepopsaných extracelulárních toxinů, produkovaných divokým kmenem B. subtilis BSB1. Jako konkurenční bakterie byl použit příbuzný mikroorganismus Bacillus megaterium. Na tomto systému byl demonstrován kontakt závislý a nezávislý způsob usmrcení konkurenční bakterie. Pomocí delečních analýz a porovnání genomů divokých kmenů B. subtilis byl zprvu identifikován profág SPβ jako oblast, která obsahuje neznámý toxin(y). Analýzou extracelulárního proteomu B. subtilis bylo následně odhaleno, že toxin (případně toxinový komplex) dosahuje molekulové hmotnosti přesahující 100 kDa. O to více bylo fascinující zjištění, že je takto veliká proteinová molekula odolná vůči působení pankreatické proteázy, trypsinu. Následné neenzymatické bromkyanové štěpení extracelulárních proteinů a jejich analýza hmotnostní spektrometrií odhalily potenciální toxinové kandidáty, které se nacházejí na profágu...
|
|
|
Mechanizmus účinku a podstata rozdílné citlivosti bakterií k antibakteriálním látkám lipofosfonoxinům
Havlová, Noemi ; Mikušová, Gabriela (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent)
Lipofosfonoxiny (LPPO) jsou syntetické antimikrobiální látky, jejichž zásahovým místem je cytoplazmatická membrána. I. generace LPPO je účinná proti Gram pozitivním bakteriím, nicméně nevykazuje aktivitu proti Gram negativním bakteriím. Po modifikaci iminocukrového modulu, nosiče pozitivního náboje, vznikla II. generace LPPO, která vykazuje rozšířené účinky proti Gram pozitivním bakteriím a je aktivní i proti Gram negativním, včetně multirezistetních kmenů. Tato práce se zaměřuje na mechanizmus účinku LPPO - zkoumá pórotvornou aktivitu těchto látek na modelových membránách i in vivo. Dále se zabývá podstatou rozdílné aktivity proti Gram pozitivním a Gram negativním bakteriím na modelových bakteriích Bacillus subtilis a Escherichia coli. Výsledky ukazují, že důvodem necitlivosti Gram negativních bakterií k LPPO I. generace, je pravděpodobně jiná stavba buněčné stěny a přítomnost vnější membrány, kterou nejsou schopné překonat. Vliv na antimikrobiální aktivitu LPPO má také fosfolipidové složení cílové cytoplazmatické membrány. Vyšší podíl fosfolipidů s neutrálním nábojem způsobuje sníženou pórotvornou aktivitu u bakterií, ale také stojí za nízkou cytotoxicitou proti eukaryotickým buňkám. Klíčová slova: Antimikrobiální peptidy, lipofosfonoxiny, pórotvorná aktivita, cytoplazmatická membrána, Bacillus...
|
|
|
Fluidizace membrány alkoholy inhibuje signalizaci DesK-DesR u Bacillus subtilis
Vaňousová, Kateřina ; Mikušová, Gabriela (oponent)
Po chladovém šoku zavádí desaturáza Des u Bacillus subtilis dvojné vazby do řetězců mastných kyselin, které jsou součástí membránových fosfolipidů. Syntéza Des je regulována dvoukomponentovým systémem DesK/DesR. DesK slouží jako senzor stavu membrány a spouští syntézu Des po poklesu fluidity membrány. Cílem této práce je zkoumat biofyzikální změny v membráně, které jsou schopny ovlivnit signalizaci DesK. S využitím lineárních alkoholů (etanolu, propanolu, butanolu, hexanolu, oktanolu) a benzyl alkoholu bylo možné potlačit syntézu Des po náhlém snížení teploty. Změny biofyzikálnch vlastností membrány způsobené přídavkem alkoholu byly sledovány pomocí membránových fluorescentních sond a diferenciální skenovací kalorimetrie. Bylo zjištěno, že fluidizace membrány vyvolaná alkoholy byla doprovázena zvýšenou hydratací na rozhraní mezi lipidy a polárním vnějším prostředím. To je spojeno s poklesem aktivity DesK. Přídavek alkoholů napodobuje nárůst teploty, který může být měřen izotermálně pomocí anizotropie fluorescence. Účinek alkoholů na periferii membrány je v souladu s konceptem mechanizmu, kdy dva hydrofilní motivy umístěné na opačných koncích transmembránové oblasti DesK, které fungují jako molekulární měřítko, vnímají teplotně závislé změny membránových vlastností.
|
|
|
Charakterizace ABC-F proteinu Sco0636 u Streptomyces coelicolor
Pinďáková, Nikola ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Mikušová, Gabriela (oponent)
Hlavním tématem této diplomové práce jsou ARE (rezistenční) proteiny z ABC-F rodiny druhé třídy ABC proteinů. ARE proteiny udílí rezistenci k antibiotikům, které se váží na velkou ribozomální podjednotku a inhibují tak proteosyntézu. Jedním z ARE proteinů je protein Lmr(C), který je součástí klastru pro biosyntézu linkomycinu u Streptomyces lincolnensis a dle nových výsledků se zdá, že Lmr(C) nemusí být striktně rezistenčním proteinem, ale může mít regulační funkci. Rozhodli jsme se pro studium Sco0636 nejbližšího homologu Lmr(C) u Streptomyces coelicolor, která je modelovým organismem při studiu sekundárního metabolismu. Díky produkci barevných pigmentů, lze sledovat vliv ARE proteinů na sekundární metabolismus přímo na plotnách. Připravila jsem deleční mutantu a kmen s konstitutivní expresí sco0636 a sledovala jsem vliv na fenotyp. Sledovala jsem produkce modrého aktinorodinu a stanovila jsem minimální inhibiční koncentrace k vybraným antibiotikům, které působí na úrovni ribozomu. Zjistila jsem, že Sco0636 udílí vysokou rezistenci k tiamulinu, a byl tak pojmenován jako TiaA. Delece genu zrychlila produkci aktinorodinu a konstitutivní exprese genu naopak produkci zpomalila. Klíčová slova: ABC proteiny, ABC-F proteiny, Lmr(C), translace, rezistence k antibiotikům, Streptomyces coelicolor, aktinorodin
|
|
|
Mechanizmus antibakteriálního účinku 4. generace lipofosfonoxinů
Helusová, Michaela ; Mikušová, Gabriela (vedoucí práce) ; Mašín, Jiří (oponent)
Lipofosfonoxiny jsou malé syntetické antimikrobiální molekuly, jejíchž zásahovým místem je cytoplazmatická membrána bakterií. Tato práce se zaměřuje na porovnání a podstatu rozdílu v aktivitě tří vybraných zástupců lipofosfonoxinů 4. generace, které se liší počtem uhlíků v jednotlivých modulech a také svou antibakteriální a hemolytickou aktivitou. Nejslibnějším kandidátem je látka 7072 vykazující dobrou antimikrobiální aktivitu a nízkou hemolytickou aktivitu. Dalšími testovanými lipofosfonoxiny jsou hemolytický 7070 a antibakteriálně slabě účinný 7107. V této práci je zkoumána jejich pórotvorná aktivita na modelových membránách i na živých buňkách Staphylococcus aureus a Escherichia coli. Výsledky naznačují, že i malý rozdíl ve struktuře může mít zásadní vliv na aktivitu těchto molekul. Lipofosfonoxiny 7072 a 7070 vykazují stejnou aktivitu proti bakteriím, kdy jejich baktericidní účinek spočívá ve vytváření pórů v cytoplazmatické membráně. Bakterie účinkem lipofosfonoxinů rychle hynou následkem ztráty membránového potenciálu. Vysoká hemolytická aktivita látky 7070 pravděpodobně souvisí s její preferencí k nenabitým membránám. Podstata slabé antimikrobiální aktivity látky 7107 je dána tvorbou pouze malých pórů a také neschopností překonat a rozrušit vnější membránu. Klíčová slova: antimikrobiální...
|
|
|
Identifikace a charakterizace mikroorganismů s biodegradačním potenciálem pro sulfonamidy
Sedláček, Jan ; Palyzová, Andrea (vedoucí práce) ; Mikušová, Gabriela (oponent)
Sulfonamidy jsou antibiotika, která se často používají jak v lidské, tak veterinární medicíně. Kombinace hojného užívání a přirozené odolnosti sulfonamidů k rozkladu vede k tomu, že často perzistují ve volné přírodě a mohou se akumulovat v živých organizmech. Uvedený fenomén vede k nežádoucím vlivům, jako jsou například toxikózy u volně žijících organizmů, nebo se výskytem antibiotik v přírodě podporuje šíření genů antibiotické rezistence mezi případnými patogenními mikroorganizmy. Tato fakta vedla ke zvyšujícímu se zájmu o studium odbourávání sulfonamidů z prostředí. V rámci této práce se podařilo izolovat a charakterizovat mikroorganizmus Acinetobacter sp. kmen 49, který je schopný biodegradovat z 80 % jeden z nejčastěji se v přírodě vyskytujících sulfonamidů - sulfamethoxazol.
|
|
|
Funkční membránové mikrodomény v cytoplazmatické membráně bakterií
Švecová, Magdaléna ; Mikušová, Gabriela (vedoucí práce) ; Koukalová, Alena (oponent)
Funkční membránové mikrodomény jsou strukturní heterogenity v cytoplazmatické membráně bakterií, které dosahují velikosti až několika desítek nanometrů. Svým lipidovým a proteinovým složením i fluiditou se liší od zbytku membrány a do velké míry tak odpovídají eukaryotickým lipidovým raftům. Membránové mikrodomény obsahují strukturní homology eukaryotického flotilinu a také hopanoidy a karotenoidy jako funkční analogy cholesterolu v lipidových raftech eukaryot. V membránových mikrodoménách bakterií jsou lokalizovány proteiny účastnící se buněčného transportu, signalizace, sekrece, tvorby biofilmu nebo sporulace. Funkční membránové mikrodomény bakterií jsou specifickým místem pro vstup některých antibiotik do buňky. Rozrušení funkčních membránových mikrodomén můžeme navíc považovat za nový mechanismus boje proti bakteriálním infekcím způsobených patogeny rezistentními ke stávajícím antibiotikům. V nepřítomnosti membránových domén totiž dochází ke ztrátě aktivity proteinů, které pro svou funkci vyžadují prostředí mikrodomén, což může vést k inhibici růstu bakteriální buňky. Klíčová slova: Funkční membránové mikrodomény, cytoplazmatická membrána bakterií, kardiolipin, hopanoidy, flotiliny, rezistence bakterií k antibiotikům
|
host ::
RSS.