|
|
Izolace bakteriálního flagelinu jako imunogenu pro přípravu protilátek pro pacienty s cystickou fibrosou
Supová, Veronika ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Cystická fibróza (CF) je autozomálně recesivní onemocnění způsobeno mutacemi v CFTR genu. Důsledkem této mutace je špatná funkce chloridového kanálku tvořeného CFTR proteinem. Díky této abnormalitě se sníží či ztratí funkce transportu chloridových iontů a tím dojde k utvoření hlenu nazývaného mukus. Mukus se nejčastěji utváří v plicích a je ideálním prostředím pro patogenní bakterie, jako například Pseudomonas aeruginosa (PA). Pseudomonas aeruginosa je aerobní, gramnegativní, podmíněný patogen, vyskytující se u pacientů se sníženou imunitou či právě u pacientů s CF, kteří jsou často hospitalizováni v nemocnici. Obsahuje jeden polární bičík, jehož vlákno je mimo jiné složeno z proteinu flagelinu. Právě bičík je jedním z nejdůležitějších virulentních faktorů bakterie PA. Tato práce je zaměřena na izolaci flagelinu z bičíku bakterie PA, který poslouží jako antigen pro přípravu profylaktických protilátek pro pacienty s CF. Flagelin byl izolován pomocí čtyř metod založených na různých kombinacích centrifugačních a precipitačních kroků. Tyto publikované metody bylo třeba optimalizovat tak, aby se podařilo izolovat flagelin. Finální preparáty a meziprodukty byly analyzovány SDS-elektroforézou na polyakrylamidovém gelu a přítomnost flagelinu byla ověřována hmotnostní spektrometrií. Z výsledku vyplývá, že...
|
|
|
Využití slepičích protilátek proti lektinu PAIIL pro prevenci infekcí Pseudomonas aeruginosa u pacientů s cystickou fibrosou
Kubíčková, Božena ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Anzenbacherová, Eva (oponent) ; Eckschlager, Tomáš (oponent)
Cystická fibróza (CF) je jedním z poměrně běžných dědičných onemocnění, způsobené mutací genu kódujícího protein CFTR, který tvoří chloridový kanál, jež významně ovlivňuje homeostázi iontů a s ní spojené hospodaření buňky s tekutinami. Toto onemocnění postihuje zejména dýchací a trávicí soustavu, avšak z hlediska ohrožení života je nejzávažnější postižení respiračního traktu. Pacienti s CF trpí častými a opakovanými infekcemi dýchacích cest, které vedou k rozvoji chronického zánětu a postupné destrukci plicní tkáně. Tyto infekce plic vyvolané většinou oportunním patogenem Pseudomonas aeruginosa, který je specifický pro pacienty s CF, jsou nejčastější příčinou morbidity a mortality těchto nemocných. V současnosti jsou v terapii infekcí Pseudomonas aeruginosa používána antibiotika, avšak vzhledem ke vzniku rezistencí jsou hledány nové způsoby antibakteriální terapie. Vedle aktivní imunizace pacientů s CF proti Pseudomonas aeruginosa nabízí slibné možnosti pasivní imunizace pacientů pomocí specifických slepičích protilátek cílených proti tomuto patogenu. Cílem předkládané disertační práce bylo proto ověřit profylaktický potenciál slepičích protilátek IgY proti virulenčnímu faktoru Pseudomonas aeruginosa - lektinu PAIIL a dále vyvinout experimentální zvířecí model napodobující podmínky v respiračním...
|
|
|
Studium profylaktického účinku glykoklastrů na modelu bakteriální adherence
Augustínová, Michaela ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Cystická fibróza (CF) je autozomálně recesivní dědičné onemocnění, které vzniká mutaci CFTR genu kódujícího CFTR protein sloužící v těle jako iontový kanál. Pro pacienty s CF je typická zvýšená adherence bakterií k plicnímu epitelu způsobená vznikem velmi hustého hlenu pokrývajícího povrch dýchacích cest a pozměněnou glykosylací v plicích. Tyto podmínky zvyšují citlivost pacientů s CF k bakteriálním infekcím plic působeným zejména Pseudomonas aeruginosa (PA). Významnou roli v patogenitě PA hrají její virulentní faktory jako jsou například lektiny PA-IL a PA-IIL, které umožňují adhezi PA na hostitelské buňky vazbou na jejich povrchové receptory obsahující D-galaktosu (PA-IL) nebo L-fukosu (PA-IIL). V této práci bylo hlavním cílem ověřit schopnost daných anti-PA-IIL slepičích protilátek a multivalentních inhibitorů PA-IIL (konkrétně tzv. glykoklastrů na bázi fukosy) zabránit adherenci PA na plicní epiteliální buňky a tím u pacientů s CF zamezit PA infekcím. Profylaktický účinek obou antiadhezivních agens (protilátky anti-PA-IIL, fukosylované glykoklastry) byl studován ex vivo na modelovém systému imortalizovaných plicních epiteliálních buněčných linií CuFi-1 izolovaných od nemocného s CF a NuLi-1 izolovaných od zdravé osoby. Pro adhezní test byl jako bakteriální model použit kontrolní kmen bakterií...
|
|
|
Studium potenciálu slepičích anti-peptidových protilátek jako prostředku profylaxe virových infekcí
Wojčíková, Lenka ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
V roce 2020 byla WHO vyhlášena celosvětová pandemie kvůli nemoci COVID-19, která je způsobovaná virem SARS-CoV-2. Tento vir využívá pro vstup do buňky navázání povrchového "spike" proteinu na ACE 2 receptor napadené buňky. Očkování se proto zaměřuje na navození produkce protilátek, které tuto vazbu inhibují. Alternativně je možno získat protilátky mimo hostitelský organismus a využít je jako prostředek pasivní imunizace proti nemoci COVID-19. Cílem práce proto bylo připravit slepičí protilátky, IgY, které by byly schopné bránit vazbě viru. Pro přípravu peptidových imunogenů byly vybrány vhodné sekvence aminokyselin ze struktury RBD domény S1 podjednotky viru SARS-CoV-2, která interaguje s ACE 2 receptorem. Syntetizované peptidy byly navázány na proteinový nosič KLH a vzniklým konjugátem byly imunizovány slepice. Následně byly vytvořené IgY izolovány z vaječného žloutku a za využití metody ELISA byla prokázána schopnost protilátek rozpoznat vybrané peptidy v různých typech antigenů. Poté byly ex vivo testovány protektivní vlastnosti protilátek proti viru v buněčných liniích a porovnány s účinností inhibice Remdesivirem. Protilátky byly při testech schopny inhibice vazby viru na buňky, ale výsledek testování byl ovlivněn nízkou počáteční koncentrací protilátek. Proto byla provedena afinitní...
|
|
|
Přeměna cabozantinibu enzymy první fáze biotransformace
Jurečka, Tomáš ; Indra, Radek (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Cabozantinib je protinádorové léčivo, které inhibuje tyrosinkinasy zprostředkovávající signalizační dráhy důležité pro růst a vývoj nádorů. Je používán pro léčbu medulárního karcinomu štítné žlázy, hepatocelulárního karcinomu a karcinomu ledvin. Hlavními enzymy první fáze biotransformace, kterými je katalyzována přeměna cabozantinibu, jsou cytochromy P450. V diplomové práci byl studován metabolismus cabozantinibu a cytochromy P450 podílející se na tomto metabolismu. V práci byly pro studium metabolismu cabozantinibu používány jaterní mikrosomy potkana, myši a králíka. Rovněž byl sledován vliv jednotlivých izoforem cytochromů P450 na metabolismus cabozantinibu za použití potkaních mikrosomů. Studována byla také časová závislost přeměny cabozantinibu jaterními mikrosomy potkana. Zahrnuto bylo také studium enzymové kinetiky přeměny cabozantinibu jaterními mikrosomy potkana a studium vlivu inhibitorů cytochromů P450 na tento metabolismus. Metabolity byly analyzovány pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) a hmotnostní spektrometrie. Tvorba metabolitů cabozantinibu rostla s časem inkubace až do 30. minuty, u některých metabolitů až do 40. minuty. Během experimentů bylo detekováno až pět metabolitů cabozantinibu (M1, desmethylcabozantinib, M3, monohydroxycabozantinib a N-oxid cabozantinibu)....
|
|
|
Studium interakce dihydromyricetinu a alkoholu in vivo
Vargová, Silvia ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Dihydromyricetin (DHM), také znám jako ampelopsin, je přírodní antioxidant nacházející se v rostlině Ampelopsis grossedentata, používaní v tradiční čínské medicíně. Dihydromyricetin vykazuje zdraví prospěšné účinky, působí např. antioxidačně, protizánětlivě, antimikrobiálně a proti rakovině. Používá se také na potlačení intoxikaci alkoholem či zmírnění projevů kocoviny nebo abstinence. Mechanismus působení DHM na metabolismus ethanolu je dodnes nejasný. Tato bakalářská práce je proto zaměřená na studium vlivu DHM na metabolismus ethanolu in vivo a vliv DHM na expresi cytochromu P450 2E1 (CYP2E1), který je jeden z hlavních enzymů účastnících se na odbourávání ethanolu v organismu. Potkaní samci byli jednorázově premedikováni ethanolem (EtOH) anebo ethanolem v kombinací s DHM a v krvi byla stanovována koncentrace EtOH. Množství EtOH a acetaldehydu v krvi jedinců svědčí, že DHM neovlivňuje rychlost metabolismu EtOH. Zároveň byl sledován vliv DHM při opakovaném premedikování EtOH. Skupina potkanů premedikována DHM vykazovala pomalejší metabolismus EtOH než skupina opakovaně premedikována pouze EtOH. Následně byl studován vliv DHM na expresi CYP2E1. Z jater potkanů byly připraveny mikrosomální frakce. Metodou Western blot s následnou imunodetekcí byla zjištěna zvýšená exprese CYP2E1 v jaterních...
|
|
|
Metabolismus inhibitorů tyrosinkinas, protinádorových léčiv nové generace
Čillíková, Olívia ; Indra, Radek (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Nádorová onemocnění jsou po infarktu myokardu druhou nejčastější příčinou úmrtí ve světě. V posledních letech se výzkum v rámci cílené chemoterapeutické léčby zaměřil na inhibitory tyrosinkinas. Vandetanib je tyrosinkinasový inhibitor ovlivňující receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR), přesmyk během transfekce (RET) a receptor 2 vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGFR-2). Primárně se využívá k léčbě medulárního karcinomu štítné žlázy. V lidském organismu je vandetanib biotransformován pomocí cytochromů P450 (CYP) a flavinmonooxygenas. Vandetanib je pomocí CYP oxidován pouze na jeden klinicky stejně účinný metabolit, a to N-desmethylvandetanib. CYP při biotransformaci chemických látek využívají primárně kofaktor NADPH. Předkládaná práce se zaobírá vlivem různých typů kofaktorů na oxidaci vandetanibu pomocí vybraných lidských rekombinantních cytochromů P450, a to CYP2C8 koexprimovaným s cyt b5, CYP2D6, CYP3A4 a CYP3A4 koexprimovaným s cyt b5, u nichž byla dříve prokázána účinná oxidace vandetanibu. Zkoumali jsme jak kofaktory NADPH, NADH a jejich směs v poměru 1:1 ovlivňují množství vzniklého N-desmethylvandetanibu při biotransformaci vandetanibu. Dále byl sledován vliv pH na oxidaci vandetanibu pomocí CYP3A4 a CYP3A4 koexprimovaného s cyt b5. Konkrétně jsme měřili množství...
|
|
| |
|
|
Biochemická charakterizace rostlin rajčete infikovaných houbovými pathogeny
Oušková, Marie ; Hýsková, Veronika (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Houbové patogeny včetně Verticillium longisporum, způsobujícího verticiliové vadnutí, patří mezi závažná onemocnění hospodářských plodin snadno šiřitelná po celém světě. Jednou z možností, jak se houbovým infekcím bránit je aplikace prostředku biologické ochrany již na semena. Účinná složka tohoto ochranného prostředku, nepatogenní oomyceta Pythium oligandrum, se tak dostává spolu se semenem do půdy, kde později působí symbioticky v kořenovém systému rostliny. Jednak stimuluje obranné mechanismy rostliny vylučováním elicitorů, jednak poskytováním tryptaminu stimuluje růst a zvyšuje zdatnost rostliny pomocí auxinu. V této práci byl sledován vliv ošetření semen rostlin Solanum lycopersicum L. cv. Micro-Tom třemi různými izoláty rodu Pythium (včetně komerčně využívaného izolátu M1 a také dosud nepoužívané izoláty X42 a X48) na aktivity antioxidačních a NADP(H)-dependentních enzymů v listech rostlin infikovaných houbovým patogenem V. longiosporum. Dva týdny po inokulaci patogenu nebyl ve studovaných enzymech nalezen významný rozdíl kromě zvýšené aktivity glukosa-6-fosfátdehydrogenasy a NADP-malátdehydrogenasy (oxalacetát- dekarboxylační) v rostlinách, jejichž semena byla ošetřena izolátem X42 a zvýšená aktivita šikimátdehydrogenasy a antioxidační kapacity v rostlinách ošetřených izolátem M1....
|
|
|
Studium enzymů sekretovaných oomycetou Pythium oligandrum
Hrdinová, Karolína ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Pythium oligandrum je jedním z nepatogenních zástupců rodu Pythium, který nalezl uplatnění jako prostředek biologické ochrany rostlin. Hlavní mechanismus účinku této oomycety spočívá v indukci obranného systému rostlin pomocí elicitorů a v mykopa- razitismu patogenních hub a houbám podobných organismů, které oomyceta napadá pomocí řady hydrolytických enzymů, jež uvolňuje do svého okolí. V první části této práce byla sledována aktivita hydrolytických enzymů endo-1,3-β-glukanasy, celulasy, chitinasy a proteas v komerčním přípravku na ochranu rostlin na bázi Pythium oligandrum, Polyversum-Biogarden. Bylo zjištěno, že přímé působení hydrolytických enzymů pravděpodobně není hlavním mechanismem účinku tohoto přípravku, nebot' aktivita glykosidas významněji narůstá až po šestihodinové inkubaci přípravku ve vodě a proteolytická aktivita nebyla prokázána. V druhé části práce byly studovány vlastnosti proteas sekretovaných oomycetou Py- thium oligandrum. Nejvyšší proteolytická aktivita byla zjištěna při pH 6,5. Ovomukoid působil jako inhibitor sekretovaných proteas. Byla sledována také stabilita proteas, kte- rou snižovaly SDS i detergenty v tekutých mýdlech, roztok tuhého mýdla nebo NaOH; močovina ji...
|
host ::
RSS.