|
|
Identifikace dědičných alterací predisponujících ke vzniku karcinomu prsu pomocí "nextgen" sekvenování.
Lhota, Filip ; Kleibl, Zdeněk (vedoucí práce) ; Zikán, Michal (oponent) ; Mohelníková Duchoňová, Beatrice (oponent)
Karcinom prsu je nejčastějším zhoubným nádorovým onemocněním v populaci žen v Evropě. Přibližně 5 - 10% případů připadá na jeho dědičnou formu, která se vyznačuje vysokou penetrancí, časným nástupem, zvýšeným rizikem rekurence a vznikem maligních onemocnění v dalších lokalizacích. Mutační analýzy vysoce rizikových pacientů identifikují kauzální mutaci v některém z nejvíce studovaných predispozičních genů (BRCA1, BRCA2, TP53, ATM, CHEK2, NBS1, PALB2) v méně než jedné třetině případů tohoto onemocnění. V poslední době byla, díky nástupu nových metod masivně paralelního sekvenování, charakterizována řada dalších predispozičních a kandidátních genů, ale výskyt jejich patogenních alterací se v jednotlivých geograficky odlišných populacích často liší. Významná část vysoce rizikových pacientů z rodin s dědičným karcinomem prsu může reprezentovat nosiče populačně specifických nebo i privátních mutací. Většina doposud identifikovaných predispozičních genů, jejichž mutace predisponují ke vzniku karcinomu prsu u vysoce rizikových osob, kóduje proteiny ovlivňující DNA reparační pochody, především pak reparaci dvouřetězcových zlomů DNA. Avšak mutační analýza byla provedena jen ve velmi malé části všech DNA reparačních genů. Lze předpokládat, že v doposud neanalyzovaných genech kódujících DNA reparační proteiny...
|
|
|
Model pro studium regulace transkripce granulocytarních genů MPO a MMP9 rozdílnými koncentracemi transkripčního faktoru PU.1
Chramostová, Kamila ; Pospíšil, Vít (vedoucí práce) ; Kleibl, Zdeněk (oponent)
7 Abstrakt Enhancery jsou distální cis - regulační sekvence DNA, které regulují (zesilují) transkripci genu řízenou z promotoru. Enhancery se nacházejí v nekódující DNA před, či za genem nebo v intronech či kódujících oblastech vzdálených až mnoho kilobází od genu. Superenhancery jsou nově objevená seskupení mnohočetných enhancerů, které hrají zásadní úlohu při aktivaci tkáňově specifických genů, určení buněčné identity a indukci diferenciace. PU.1 je transkripční faktor (TF) nezbytný pro normální krvetvorbu, konkrétně pro vývoj myeloidní a lymfoidní krevní řady. Přesná koncentrace PU.1 je zodpovědná za diferenciaci krvetvorných buněk do odlišných buněčných linií a jejich narušení vede k leukemogenezi. Vysoké koncentrace PU.1 stimulují makrofágový vývoj, zatímco střední koncentrace stimulují vývoj granulocytů. Jakými regulačními mechanismy je zajištěno, že granulocytární geny jsou aktivovány výhradně ve střední koncentrací PU.1, zatímco makrofágové ve vysoké, je zajímavá biologická otázka, k jejímuž zodpovězení se snaží přispět i tato diplomová práce. Cílem této diplomové práce bylo vytvořit sérii reportérových vektorů nesoucí regulační oblasti granulocytárních genů MPO a MMP9, které by umožnily studium mechanismů, jak jsou různé koncentrace TF PU.1 vnímány regulačními sekvencemi cílových genů. Na základě...
|
|
|
Regulace genové exprese v nádorové tkáni
Kulda, Vlastimil ; Černý, Radim (vedoucí práce) ; Vachtenheim, Jiří (oponent) ; Kleibl, Zdeněk (oponent)
Deregulace genové exprese způsobená genetickými a epigenetickými změnami hraje důležitou roli v patogenezi nádorových onemocnění. Tato disertační práce je komentovaným souborem deseti publikovaných prací zabývajících se problematikou molekulární biologie nádorů, na jejichž vzniku se autor významným způsobem podílel. Všechny práce obsažené v souboru spojuje téma stanovení molekul, které se podílejí na regulaci genové exprese (mikroRNA) nebo změn na úrovni DNA, které ovlivňují expresi genů (methylace promotoru, přítomnost fúzního genu). MikroRNA jsou krátké jednovláknové RNA molekuly, které regulují genovou expresi na posttranskripční úrovni urychlením degradace mRNA nebo inhibicí translace. Jedná se o základní mechanismus s vlivem na všechny buněčné procesy včetně patogeneze různých nemocí. MikroRNA mohou působit jako onkogeny snižováním exprese tumor supresorových genů nebo naopak jako tumor supresory snižováním exprese onkogenů, ale dnes už víme, že síť mikroRNA - RNA interakcí je mnohem komplexnější. Námi publikované výsledky, které jsou součástí této práce, se týkají kolorektálního karcinomu (CRC), karcinomu prostaty, dlaždicobuněčných karcinomů hlavy a krku (HNSCC), karcinomu žaludku a nemalobuněčného karcinomu plic (NSCLC). U pacientů s CRC jsme prokázali prognostický význam miR-21. Ve tkáni...
|
|
|
Regulation of the DNA damage response by R2TP mediated MRN complex assembly and control of 53BP1 localisation.
Von Morgen, Patrick ; Hořejší, Zuzana (vedoucí práce) ; Bártová, Eva (oponent) ; Kleibl, Zdeněk (oponent)
(Czech) Dvouvláknové zlomy jsou nejnebezpečnějším typem poškození DNA. Proteinový komplex MRN a protein 53BP1 hrají důležitou roli při opravě dvouvláknových zlomů DNA a jsou proto nezbytné pro udržení stability DNA a prevenci rakoviny. Dvouvláknové zlomy mohou být opraveny dvěma hlavními způsoby - homologní rekombinací a nehomologním spojením konců DNA. MRN detekuje dvouvláknové zlomy DNA a aktivuje signalní kaskády vedoucí k opravě DNA nebo buněčné apoptoze. Zároveň komplex MRN pomáhá během nehomologního spojení konců DNA začistit konce DNA a vytvořit jednořetězcové úseky DNA potřebné pro homologní rekombinaci. 53BP1 inhibuje resekci DNA, čímž podporuje nehomologní spojení konců na úkor homologní rekombinace. V této práci ukazujeme, že MRE11 se váže na šaperonový komplex R2TP prostřednictvím místa fosforylovaného CK2. Snížení hladiny R2TP komplexu nebo zmutování vazebného místa pro MRE11 vede k destabilizaci MRE11 a k narušení opravy DNA. Podobný fenotyp byl pozorován v buňkách pacientů s dědičným syndromem ataxie-telangiectasie (ATLD), které obsahují zkrácený protein MRE11, v němž chybí vazebné místo pro komplex R2TP. Vzhledem k funkci R2TP jako molekulárního šaperonu předpokládáme, že R2TP je důležitý pro sestavovaní nebo kontrolu kvality komplexu MRN. Dále jsme prozkoumali procesy důležité pro...
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
|
Funkční analýza populačně specifických sekvenčních variant genu pro kinázu kontrolního bodu buněčného cyklu CHEK2
Stolařová, Lenka ; Kleibl, Zdeněk (vedoucí práce) ; Živný, Jan (oponent)
Gen CHEK2 kóduje serin/threoninovou kinázu Chk2 (Checkpoint kinase 2) aktivovanou v reakci na poškození genomové DNA. Aktivovaná Chk2 kináza dále fosforyluje své substráty (proteiny Cdc25C, BRCA1 nebo p53), a jejich aktivace pak vede k pozastavení buněčného cyklu, reparaci DNA, nebo indukci apoptózy. Vrozené mutace genu CHEK2 zvyšují riziko nádorových onemocnění (především karcinomu prsu a kolorekta). Analýza vysoce rizikových pacientek s karcinomem prsu v ČR prokázala přítomnost vzácných (především missense) mutací CHEK2 s nejasným klinickým významem. Tato práce se zabývá studiem funkčního vlivu těchto variant in vitro a stanovením kinázové funkce variantních izoforem kinázy Chk2. Za tímto účelem byly zkonstruovány plazmidy exprimující studované varianty v bakteriálních buňkách E. coli. Enzymová aktivita izoforem Chk2 kinázy byla v bakteriálním lyzátu stanovena spektrofotometricky na základě fosforylace arteficiálního substrátu Chk2. Kinázová aktivita bylo korelována s výsledky predikčních programů hodnotících funkční význam studovaných variant in silico. Z výsledků vyplývá, že z 15 missense mutací (a jedné delece neporušující čtecí rámec) vedou ke ztrátě kinázové aktivity všechny varianty v kinázové doméně Chk2, které jsou rovněž většinou predikčních algoritmů identifikované jako patogenní mutace. Takto...
|
|
|
Současné metody analýzy genomu a jejich využití v hledání genetických příčin nemocí
Stránecký, Viktor ; Kmoch, Stanislav (vedoucí práce) ; Kleibl, Zdeněk (oponent) ; Pačes, Jan (oponent)
Studium vzácných onemocnění je vhodným přístupem pro nalezení genetické a molekulární podstaty lidských znaků a výrazně napomohlo k identifikaci genů, objasnění jejich funkce a přispělo k charakterizaci funkce metabolických drah a buněčných procesů. V průběhu posledních 30-ti let byla vazebná analýza nejúspěšnějším přístupem k hledání genů podmiňujících Mendelovská onemocnění a přispěla k identifikaci řady genů, přesto podstata mnohých onemocnění zůstává stále neznámá. Nové metody studia lidského genomu, zejména technologie DNA čipů, masivně paralelní sekvenování (next generation sequencing) a metody analýzy takto získaných dat, představují způsob jak efektivně identifikovat příčinu geneticky podmíněných onemocnění na základě přímého pozorování mutací v celém genomu postižených jedinců. Tyto metody nahrazují tradiční způsob identifikace genů reprezentovaný vazebnou analýzou a sekvenovaním kandidátních genů a stávající se standardním přístupem pro objasnění molekulární podstaty onemocnění. V této práci popisuji možnosti studia vzácných genetických podmíněných onemocnění a výsledky dosažené s využitím těchto postupů - identifikaci genů podmiňujících mukopolysacharidózu typ IIIC (TMEM76), izolovaný defekt ATP syntázy (TMEM70), Rotorův syndrom (SLCO1B3 a SLCO1B1), autozomálně dominantní ANCL (DNAJC5) a...
|
|
|
The functional in vitro analysis of the BRCA1alternative splicing variants
Ševčík, Jan ; Kleibl, Zdeněk (vedoucí práce) ; Stopka, Tomáš (oponent) ; Macůrek, Libor (oponent)
Úvod: Inaktivace tumor supresorového genu BRCA1 je predispozičním faktorem vzniku karcinomu prsu a ovaria. Vznik funkčně odlišných nádorově specifických alternativních sestřihových variant může být možným mechanismem snižujícím aktivitu BRCA1 v procesu reparace dvouřetězcových zlomů DNA (DDSB). V této práci jsme funkčně charakterizovali dvě alternativní sestřihové varianty BRCA114-15 a BRCA117-19, nalezené v průběhu genetického screeningu jedinců s vysokým rizikem vzniku karcinomu prsu.Metody: Pro funkční in vitro analýzu jsme vytvořili modelový systém klonů buněčné linie MCF-7 stabilně exprimujících zkoumané varianty. Pomocí comet assay a konfokální imunomikroskopie jsme v tomto systému sledovali vliv BRCA114-15 a 17-19 variant na kinetiku reparace DDSB a proliferaci. Aktivita DNA reparačních procesů byla stanovena přímo pomocí in vitro NHEJ assay a nepřímo testem senzitivity na mitomycin C. Proliferační aktivita byla stanovena klonogenním testem a růstovými křivkami. Výsledky: Exprese BRCA114-15 a 17-19 zvyšuje v MCF-7 buňkách úroveň endogenního poškození DNA, zpomaluje reparaci DDSB, negativně ovlivňuje tvorbu reparačních komplexů v počáteční fázi reparace a prodlužuje jejich trvání. Varianty BRCA114-15 a 17-19 rozdílně ovlivňují aktivitu HR, NHEJ a radiosensitivitu MCF-7 buněk. Závěr: Zvýšení exprese...
|
host ::
RSS.