|
|
Strukturní charakterizace interakce Nkr-p1f/Clrg
Tůmová, Lucie ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Ptáčková, Renata (oponent)
NK buňky jsou řazeny mezi lymfocyty, které se účastní primární odpovědi imunitního systému na viry infikované a nádorové buňky. Současně produkují cytokiny a zapojují se do tvorby sekundární imunitní odpovědi spolu s T a B lymfocyty. Tato diplomová práce se zabývá studiem struktury a interakce membránového receptoru Nkr-p1f spolu s ligandem Clr-g. Receptor Nkr-p1f má aktivační funkci a je schopen zahájit cytotoxickou funkci NK buněk. Trojrozměrná struktura byla vyřešena u homodimeru Clr-g, ale jeho interakce s receptorem dosud ne. Cílem práce bylo připravit produkční vektor celé extracelulární části receptoru Nkr-p1f a provést produkci Nkr-p1f a Clr-g v prokaryotickém expresním systému. Následně provést renaturaci a purifikaci proteinů in vitro. Tímto způsobem připravené proteiny byly analyzovány elektroforeticky a hmotnostní spektrometrií. Jejich interakce byla sledována biofyzikální metodou, povrchovou plasmonovou rezonancí (SPR). Avšak interakce mezi nimi nebyla technikou SPR odhalena.
|
|
|
Příprava myšího interleukinu 2 spojeného s monoklonální protilátkou S4B6
Rožová, Dominika ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Interleukin 2 je růstový faktor T buněk, ale i dalších lymfocytů, jako jsou NK, NKT buňky, dendritické a žírné buňky, které zajišťují jeho expresi a sekreci. IL-2 reguluje homeostázu imunitních buněk a používá se k léčbě řady poruch včetně rakoviny a autoimunitních chorob. V posledních letech bylo popsáno několik případů, kdy komplex interleukinu 2 s protilátkou anti-IL2 vykazoval mnohonásobně vyšší biologickou aktivitu in vivo. Tyto komplexy mají selektivní stimulační aktivitu pro různé receptory cílových buněk. Tato práce navazuje na předchozí neúspěšné pokusy o expresi a purifikaci dostatečného množství imunokomplexu myšího IL2 s protilátkou S4B6 spojenou 15 aminokyselinovou glycin-serinovou spojkou. V rámci této práce byl připraven plazmid obsahující gen pro fúzní sekretovaný imunokomplex mIL2-S4B6, kterým byla následně stabilně transfekována buněčná linie HEK293T pomocí systému piggyBac. Protein byl následně izolován chelatační afinitní chromatografií a purifikován gelovou permeační chromatografií.
|
|
|
Studies of NK cell receptors and other proteins using recombinant expressions and mass spectrometry
Kavan, Daniel
Receptor CD69 je považován za marker aktivovaných lymfocytů a je exprimován na všech místech aktivní imunologické odpov diě . Fyziologicky se vyskytuje jako disulfidicky vázaný homodimer, ovšem z modelu je patrné, že k dimerizaci krom disulfidického m stku značnou mírou p ispívá také kontaktě ů ř Q93 jedné a D88 spolu s E87 na druhé podjednotce a ješt výrazn jiě ě R134 jedné a A136 a Y135 druhé. Na základ tohoto pozorování byly Q93, R134 nebo oboje mutoványě na alaniny a následn ukázáno, že jako monomer se chovala jen dvojnásobn zmutovanáě ě forma. Tato skutečnost m la také významný vliv na vazbu sacharidových ligand , neboě ů ť monomerní forma vykazovala výrazn nižší afinitu ke GlcNAcu (ě Kd ádov 10ř ě -5 M), než forma dimerní (Kd ádov 10ř ě -6 M) nebo dokonce delší kovalentn dimerní konstruktyě (Kd ář dov 10ě -7 M). Oproti pozorovanému kratšímu času eluce z gelov filtrační kolonyě po vysycení receptoru ligandem (GlcNAc), který by mohl naznačovat zm nu struktury,ě však experimenty v analytické ultracentrifuze neukázaly žádnou zm nu sedimentačníhoě koeficientu, podobn ani porovnání nam ených HSQC NMR spekter p ed a po vysyceníě ěř ř ligandem neodhalily žádné výrazné zm ny.ě Vodíko-deuteriová vým na je chemický d j, p i kterém je kovalentně ě ř ě vázaný atom vodíku vym n n za deuterium, nebo...
|
|
|
Sledování vlivu quambalarinu B na aminokyselinový metabolismus leukemických buněčných linií
Matoušková, Zuzana ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Prošková, Veronika (oponent)
Leukémie je nejčastější onkologické onemocnění u pacientů dětského věku, avšak ani u starších pacientů není toto onemocnění vzácné. To je hlavní důvod, že se v posledních letech výzkum zaměřil na vývoj specifických antileukemických léčiv. Klíčové se zdají být abnormality metabolismu nádorových buněk na které se dá cílit při léčbě. Přírodní 1,4-naftochinony, mezi něž patří i quambalarin B produkovaný jako sekundární metabolit basidiomycetami Quambalaria cyanescens, jsou známé pro své léčebné účinky. Není tak překvapením, že i u quambalarinu B bylo prokázáno, že u některých leukemických buněčných linií inhibuje buněčnou proliferaci a následně způsobuje buněčnou smrt. V předkládané práci jsem se pomocí aminokyselinové analýzy s fluorescenční detekcí snažila pozorovat změny metabolismu aminokyselin, a to sledováním aminokyselinových hladin v intracelulárním a extracelulárním prostředí leukemických buněk po ošetření quambalarinem B. Pozorování bylo prováděno u buněčné linie Jurkat, Ramos a THP-1, přičemž každá z těchto linií představuje jiný typ leukemického onemocnění. Klíčová slova Aminokyselinová analýza, metabolismus aminokyselin, quambalarin B, leukémie
|
|
|
The novel combinations of experimental approaches: mass spectrometry (MS) and photo-induced surface labelling, electron release (PIER), or cross-linking (PIXL)
Tuzhilkin, Roman ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
V živých organismech probíhá každým okamžikem nespočet dějů s účastí přenosu/transportu elektronu (ET). Proto jejich studium je důležitým cílem moderní strukturně-funkční proteomiky. Pro řadu experimentů byl a je používán modelový protein azurin z P. aeruginosa. Tento modrý protein obsahující centrální atom mědi má charakteristické absorpční maximum při 630 nm v redoxním stavu Cu(II). Během jeho oxidace na Cu(I) dochází k poklesu hodnoty absorbance při 630 nm (A630) a tak lze UV-Vis spektra použít pro sledování průběhu jeho ET reakcí. Naším cílem bylo vložit světlem aktivovatelný strukturní analog kanonické aminokyseliny Met - L-2-amino-5,5-azihexanovou kyselinu (foto-Met) - do sekvence azurinu a využít vzniklý proteinový produkt pro studium oligomerizace azurinu v roztoku pomocí techniky světlem iniciovaného síťování (PIXL). Použitím optimalizovaných protokolů pro rekombinantní expresi v E. coli B834 jsme vložili foto-Met do přirozeného azurinu a konstruktu Az2W, ve kterém jsou přítomny dva blízké Trp, u kterých byla potvrzena role při elektronovém přeskoku ("hopping") napříč protein-proteinovým rozhraním. Míra inkorporace foto-Met do sekvence proteinů byla určena pomocí MALDI-TOF MS po separaci proteinů na SDS-PAGE a štěpení proteasou v gelu. Pomocí metody PIXL byl studován vliv rostoucí celkové...
|
|
| |
|
|
Příprava myšího interleukinu 2 spojeného s monoklonální protilátkou S4B6
Rožová, Dominika ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Interleukin 2 je růstový faktor T buněk, ale i dalších lymfocytů, jako jsou NK, NKT buňky, dendritické a žírné buňky, které zajišťují jeho expresi a sekreci. IL-2 reguluje homeostázu imunitních buněk a používá se k léčbě řady poruch včetně rakoviny a autoimunitních chorob. V posledních letech bylo popsáno několik případů, kdy komplex interleukinu 2 s protilátkou anti-IL2 vykazoval mnohonásobně vyšší biologickou aktivitu in vivo. Tyto komplexy mají selektivní stimulační aktivitu pro různé receptory cílových buněk. Tato práce navazuje na předchozí neúspěšné pokusy o expresi a purifikaci dostatečného množství imunokomplexu myšího IL2 s protilátkou S4B6 spojenou 15 aminokyselinovou glycin-serinovou spojkou. V rámci této práce byl připraven plazmid obsahující gen pro fúzní sekretovaný imunokomplex mIL2-S4B6, kterým byla následně stabilně transfekována buněčná linie HEK293T pomocí systému piggyBac. Protein byl následně izolován chelatační afinitní chromatografií a purifikován gelovou permeační chromatografií.
|
|
| |
|
|
Přiřazení rezonančních frekvencí atomům proteinové páteře myšího proteinu Nkrp1c
Nelic, Dominik ; Chmelík, Josef (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Protein Nkrp1c je receptor na povrchu myších přirozeně zabíječských buněk (natural killer cells) imunitního systému, který patří do rodiny C-lektin receptorů. Tyto buňky vytvářejí vrozenou imunitu proti nádorům či patogenům před vznikem protilátek. Určení 3D struktury proteinů je často klíčem pro pochopení funkce proteinu na molekulární úrovni. Jednou z možností, jak určit strukturu proteinů na atomární úrovni, je nukleární magnetická rezonance. Náplní této bakalářské práce bylo vyhodnocení několika již naměřených spekter a přiřazení rezonančních frekvencí atomů peptidové páteře potřebných pro získání dat na predikci sekundární struktury pro protein Nkrp1c, který byl připravený rekombinantní expresí. K vyhodnocení naměřených spekter byl využit program Sparky. Samotná predikce sekundární struktury proteinu Nkrp1c byla provedena programy Talos+ a PSIPRED. Získané výsledky byly porovnány s již publikovaným homologním modelem receptoru proteinu Nkrp1c. Klíčová slova: NMR proteinu, Nkrp1c
|
|
|
Study of mechanism of signal transduction in case of two model heme-containing sensor proteins
Mihalčin, Peter ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Hemové senzorové proteíny, ktoré detekujú plynné molekuly tvoria skupinu proteínov prítomných v signálnych dráhach baktérií. Precízna regulácia fyziologických funkcií ako medzibunková komunikácia či produkcia biofilmu je zásadná pre prežitie baktérií a ich adaptáciu na okolité podmienky. Hemové senzorové proteíny detekujú koncentráciu plynných molekúl v okolitom prostredí senzorovou doménou (ktorá obsahuje molekulu hemu ako vlastné detekčné miesto) a prenášajú signál na funkčnú doménu, ktorá pomáha riadiť adaptáciu fyziologických procesov. Tieto procesy často patogénneho prejavu prispievajú k rozšírenej rezistencií baktérii voči antibiotikám. Hemové senzorové proteíny sa javia ako nový terapeutický objekt v antimikrobiálnej liečbe. Za účelom realizácie tohto typu terapie je najskôr nutné pochopiť presný mechanizmus intramolekulárneho prenosu signálu hemovými senzorovými proteínmi. Jeden z prístupov ako odhaliť tieto mechanizmy je štúdium modelových signálnych proteínov. Táto diplomová práca je zameraná na výskum prenosu signálu dvoma modelovými hemoproteínmi s globínovou štruktúrou senzorovej domény, ktoré detekujú kyslík.
|
host ::
RSS.